보골지는 서울 경동시장에서 구입하였고, 보골지 50 g을 증류수 500 mL와 함께 round flask에 넣고 2 h 동안 가열 추출한 후 rotary evaporator (Eyela, Tokyo Rikakikai Co., Ltd., Japan)로 감압 농축하고 동결건조기로 건조하여 얻은 10.84 g (10.4%)의 분말을 시료로 사용하였다.

HaCaT 세포는 한국세포주은행(Korea)에서 구매하여 사용하였으며, 세포배양을 위한 Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM), fetal bovine serum (FBS)는 Welgene (Korea)에서, 항생제(penicillin/streptomycin)는 Invitrogen (USA)에서 구입하여 사용하였다. HaCaT 세포는 37℃로 유지되고 5% CO₂, 100% 습윤배양기에서 배양하였다.

UVA 조사로 인한 HaCaT 세포의 노화를 확인하기 위해서 UVA를 하기와 같은 조건으로 처리하였다. HaCaT 세포가 배양되고 있는 35 mm 조직배양접시에 phenol red가 첨가되지 않은 DMEM을 접종한 후 자외선 조사장치 (BLX crosslinker; Bio-Link, France)를 사용하여 5 J/cm²의 UVA를 조사하였다.

세포 생존율은 Cell Counting Kit-8 (CCK-8; Dojindo Molecular Technologies Inc., Japan) 분석법을 이용하였다. HaCaT 세포를 조직배양접시에 접종한 후 보골지 추출물을 농도별로 처리하였다. 농도별 처리한 HaCaT 세포를 24 h 배양한 후 CCK-8 시약을 첨가하여 1 h 동안 5% CO₂, 37℃ 배양기에서 배양하였다. ELISA reader (BioTek Instruments Inc., USA)를 사용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 세포를 첨가하지 않은 배지만 넣은 대조군의 흡광도를 기준으로 세포 생존율을 산출하였다.

TRIzol Reagent (Gibco, USA)를 사용하여 RNA를 추출하였다. 추출한 RNA로부터 cDNA의 합성은 ReverTra Ace 역전사 효소 키트 (Toyobo Co., Ltd., USA)를 사용하여 합성하였으며, HaCaT 세포 표지인자의 발현을 비교 측정하기 위하여 Real-time RT-PCR (Applied Biosystems, USA)을 진행하였다. 실험에 사용된 특정 Taqman Gene expression assay는 Table 1과 같다.

보골지 열수 추출물이 히알루론산의 생성에 미치는 영향을 알아보기 위하여 HaCaT 세포를 24 h 동안 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 전 배양한 후, 자외선 조사기를 통해 5 J/cm²의 UVA를 조사하였다. 조사 후 보골지 추출물을 첨가하여 48 h 동안 배양하였다. Hyaluronic acid-ELISA kit (Corgenix Inc., USA)를 이용하여 제조사의 프로토콜을 따라 HaCaT 세포가 분비하는 배양액 내의 히알루론산의 양을 측정하였다.

통계처리는 Student’s T-test법을 이용하여 유의 수준을 0.05 (p<.05)로 하여 검정하였다.

HaCaT 세포에 대한 보골지 열수 추출물의 세포독성에 대한 영향을 확인하기 위하여 CCK-8 assay를 실시하였다. 대조군은 시료를 처리하지 않았고 보골지 열수 추출물은 1, 10, 100 ng/mL, 1, 10, 100, 1000 μg/mL의 농도로 처리하여 세포생존율을 측정하였다(Figure 1A). 100 μg/mL 이상의 농도를 처리할 때 HaCaT 세포의 생존율이 유의성 있게 감소하여, 추가적으로 10 μg/mL과 100 μg/mL의 농도를 세분화하여 CCK-8 assay를 수행하였다(Figure 1B). 50 μg/mL의 농도로 처리시에는 HaCaT 세포의 생존율이 대조군과 비교하여 유사함을 확인하여 본 실험에서는 50 μg/mL의 보골지 열수 추출물을 처리하여 추가실험을 진행하였다.

HaCaT 세포에 5 J/cm²의 UVA를 한 차례 조사한 후 보골지 열수 추출물을 처리하여 HaCaT 세포가 발현하는 보습인자인 HAS2와 AQP3의 발현양을 실시간 유전자 중합효소 연쇄반응을 통하여 확인하였다. HAS2와 AQP3는 인간 각질형성세포에서 발현하는 유전자로 보습에 관여하는 인자로 알려져 있다. 자외선 조사에 의해 HaCaT 세포는 HAS2, AQP3와 같은 인간 각질형성세포 보습인자의 발현이 감소한다. 보골지 열수 추출물을 처리하고 실시간 유전자 중합효소 연쇄반응을 통하여 HaCaT 세포의 표지인자 발현을 확인한 결과, 자외선 처리군 대비 HAS2의 발현이 2.5배, AQP3의 발현이 2.8배 가량 증가하는 효과를 보였다(Figure 2). 수분을 특이적으로 세포 내로 수송하는 역할을 담당하는 AQP3과 히알루론산을 생성하는 효소인 HAS2의 유전자 발현을 증가시키는 결과를 통해 보골지 열수 추출물이 피부에 보습 효능이 있는 것으로 사료된다 (Sougrat et al., 2002; Hara-Chikuma & Verkman, 2008; Hašová et al., 2011).

Hyaluronan synthase 2 (HAS2)는 인간각질형성세포에서 히알루론산을 생합성하는데 중요한 역할을 하는 효소로 알려져 있다(Karvinen et al., 2003; Kim et al., 2004). 보골지 열수 추출물을 처리하여 HAS2 mRNA의 발현량이 증가된 HaCaT 세포에서 히알루론산 단백질의 생성 역시 증가되는지를 알아보기 위해 히알루론산에 대한 효소결합 면역흡착법(ELISA)을 사용하여 측정하였다(Figure 3). 실험결과, 자외선 조사에 의해 33% 가량 생성이 감소되었던 히알루론산이 보골지 열수 추출물 처리에 의해 자외선 처리군 대비 38% 가량 증가함을 확인하였다. 이 결과는 HAS2 mRNA에 대한 실시간 유전자 중합효소 연쇄반응의 실험 결과와 유사하며, 보골지 열수 추출물은 HAS2 mRNA의 발현을 증가시킬 뿐 아니라 히알루론산의 생성 역시 촉진시킬 수 있음을 시사한다.

인간각질형성세포는 기저층에서 각질층으로 분화가 진행되면서 각질화되어 탈락되는 각질턴오버를 거친다. 기저층의 각질형성세포가 유극층, 과립층, 각질층으로 분화가 되면서 KRT5, KRT14과 같은 표지인자의 발현을 감소하고 KRT1, KRT10, FLG, loricrin (LOR)과 같은 단백질의 발현은 증가한다고 알려져 있다(Eckert et al., 2005). 따라서 기저층의 인간각질형성세포의 표지인자로 KRT5와 KRT14 등의 단백질이 과립층의 인간각질형성세포는 KRT1, KRT10, FLG, LOR 등의 단백질이 표지인자로 활용된다. 표피층이 자외선과 같은 외인성 노화의 스트레스를 받게 되면 인간각질형성세포의 분화가 촉진되어 과각질화가 유도된다. 본 실험에서는 HaCaT 세포에 UVA를 조사하여 분화를 촉진한 상태에서 보골지 열수 추출물을 처리했을 때 분화된 인간각질형성세포의 표지인자인 FLG, LOR, KRT1, KRT10의 발현을 실시간 유전자 중합효소 연쇄반응으로 확인하였다. 자외선에 의해 FLG, KRT1, KRT10의 발현이 현저하게 증가하였고, LOR의 발현에는 큰 영향을 끼치지 않았다. 여기에 보골지 열수 추출물을 처리하게 되면 KRT1, KRT10의 발현이 자외선 처리군 대비 각각 30%, 50% 감소함을 확인할 수 있다(Figure 4). 이는 자외선이 인간각질형성세포의 분화를 유도하여 과각질화를 유발하지만 보골지 열수 추출물이 KRT1과 KRT10의 발현을 유의적으로 감소시켜 분화가 과도하게 유도되는 현상을 억제시킬 수 있음을 보여준다.