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Asian J Beauty Cosmetol > Volume 20(1); 2022 > Article
지방유래 3차원(3D) 줄기세포 조건화 배지가 함유된 크림이 피부탄력에 미치는 영향

요약

목적

본 연구에서는 3차원 지방조직유래 중간엽줄기세포 조건화 배지(three-dimensional human adipose tissue derived mesenchymal stem cell conditioned medium, 3D ADMSC-CM)를 함유한 크림이 피부탄력에 미치는 효능에 관한 연구를 진행하고자 한다.

방법

3D ADMSC-CM의 세포 증식능력, EGF와 VEGF의 발현량을 확인한다. 3D ADMSC-CM이 함유된 크림의 콜라겐(collagen1) 발현량을 검증하며, 리프팅, 피부탄력, 피부탄성복원력 등 임상적 효능 평가를 진행한다.

결과

인간 진피유래 섬유아 세포의 형태적 변화가 관찰되지 않았으며, 농도 의존적으로 세포의 생존율이 증가하는 것으로 나타났다. EGF의 분비량은 2.692 pg/mL, VEGF는 27.89 pg/mL을 분비하였다. 3D ADMSC-CM 크림의 콜라겐(collagen 1)이 발현량은 183%로 증가하는 것을 확인 할 수 있었다. 3D ADMSC-CM 크림 사용에 의한 임상적 효능 평가에서 리프팅 효과를 측정한 결과 적용 2주 후와 4주 후에 유의미한 효과를 보였다. 피부탄력 및 피부탄성복원력을 변수 별 측정값을 분석한 결과 적용 2주 후와 적용 4주 후에 모두 개선 효과가 있는 것으로 나타났다.

결론

본 연구에서 인체 구조와 비슷한 환경에서 배양된 3D ADMSC-CM이 함유된 크림을 통해 피부탄력 증진에 매우 효과적이며, 3D ADMSC-CM은 코스메슈티컬 시장을 선도할 것으로 기대된다.

Abstract

Purpose

In this study, the effect on skin elasticity of a cream containing three-dimensional human adipose tissue derived mesenchymal stem cell conditioned medium (3D ADMSC-CM) was examined.

Methods

The clinical efficacy of the cream was evaluated by examining the skin for skin lifting, elasticity, and resilience after examining the cell proliferative capacity, expression levels of epidermal growth factor (EGF) and vascular endothelial growth factor (VEGF) in 3D ADMSC-CM, and collagen expression in skin cells due to the 3D ADMSC-CM cream.

Results

Skin cell viability was well maintained, with no cytotoxicity from the 3D ADMSC-CM. The amount of EGF and VEGF contained in the 3D ADMSC-CM was 2.692 pg/mL and 27.89 pg/mL, respectively. In addition, skin cells treated with the 3D ADMSC-CM cream experienced a collagen expression increase of 183%. In clinical evaluation of the 3D ADMSC-CM cream, skin lifting and skin elasticity improvement showed significant effects at both two and four weeks. After the 3D ADMSC-CM cream was used, the improved skin elasticity and resilience was analyzed by variables, and an improvement was observed in both after two and four weeks of use.

Conclusion

A cream containing 3D ADMSC-CM derived from a 3D culture environment, similar to that of an in vivo environment, is highly effective in enhancing skin elasticity, and 3D ADMSC-CM is expected to lead the field of cosmeceuticals.

中文摘要

目的

在本研究中,研究了含有三维人体脂肪组织来源的间充质干细胞条件培养基(three-dimensional human adipose tissue derived mesenchymal stem cell conditioned medium, 3D ADMSC-CM)的霜对皮肤弹性的影响。

方法

检查3D ADMSC-CM的细胞增殖能力和EGF、VEGF的表达水平。验证含有3D ADMSC-CM的霜的胶原蛋白(collagen1)表达水平,并评估提升、皮肤弹性和皮肤弹性恢复的临床疗效。

结果

皮肤细胞活力保持良好,3D ADMSC-CM没有细胞毒性。3D ADMSC-CM中 EGF和VEGF的含量分别为2.692 pg/mL和27.89 pg/mL。此外,用3D ADMSC-CM霜处理的皮肤细胞的胶原蛋白表达增加了183%。在3D ADMSC-CM霜的临床评估中,皮肤提升和皮肤弹性改善在两周和四周均显示出显着效果。使用3D ADMSC-CM霜后,通过变量分析改善的皮肤弹性和皮肤弹性恢复的测量值,发现使用两周和四周后均观察到改善。

结论

含有类似于体内环境的3D培养环境中的3D ADMSC-CM的乳霜在增强皮肤弹性方面非常有效,3D ADMSC-CM有望引领药妆领域。

Introduction

보건의료 기술의 발달로 인간의 수명이 연장되면서 노화 속도를 저지하고자 하는 노력은 인간의 자연스러운 욕구 중 하나가 되었다. 아름다운 모습으로 살아가기 위한 젊은 세대의 인식변화에 따라 미의 개념도 변화되고 있다. 단순히 오래 사는 것이 아니라 피부미용을 위해 아낌없이 투자하며, 아름답고 건강한 삶을 추구하는 사람들이 증가하고 있다. 화장품, 제약 분야를 중심으로 안티에이징에 대한 관심도가 증가하면서 관련 시장도 지속적으로 성장하며 빠른 변화를 보이고 있다. 안티에이징에 대한 관심은 미용기기, 화장품, 건강기능식품에 대한 시장의 성장과 변화를 주도하고 있다.
우리는 일상에서 빛, 자외선, 미세먼지 등과 같은 외부 환경의 지속적인 공격을 받고 있다. 이러한 외부 자극은 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)을 생성하여 피부 세포의 손상과 사멸을 유도하고 피부의 탄력저하, 주름 생성 등의 피부노화를 가속화 시킨다(Kim et al., 2011; Yoon et al., 2013). 피부노화를 예방하기 위해 바이오 화장품에 대한 관심도가 점차 증가되며 고기능성 화장품에 대한 선호도가 증가되고 있다. 이에, 제약•바이오 기업 등은 줄기세포 배양기술이나 엑소좀 추출 기술(Li et al., 2019; Patel et al., 2019) 등과 같은 첨단화된 바이오 기술력을 바탕으로 유전자, 단백질, 세포 등을 이용한 고기능성 제품 개발에 주력하고 있고 있다(Kim et al., 2019). 줄기세포배양액은 2010년부터 본격적으로 화장품 원료로 사용되기 시작하였으며, 최근까지 줄기세포배양액을 함유한 고기능성 화장품들이 지속적으로 출시되고 있는 추세이다.
줄기세포는 세포학적 출처에 따라 배아 줄기세포(embryonic stem cells)와 성체 줄기세포(adult stem cells) 두 종류로 나뉘어 설명하고 있다(Joseph, 2006). 이 중 성체 줄기세포는 세포 분열을 통해 증식이 일어나며, 다양한 활성인자와 세포외기질 분비로 세포 노화를 억제한다. 줄기세포를 배양한 배양액에는 EGF, VEGF, collagen 등과 같은 다양한 성장 인자가 함유 되어있어 줄기세포배양액 내의 유 효단백질은 mRNA 발현을 촉진시켜 섬유아세포의 collagen 생합성을 증가시키기 때문에 주름개선에 효과가 있다고 알려져 있으며(Kim et al., 2009), nude rat를 이용한 상처 모델에서 상처치유에도 효과가 있다고 알려져 있다(Nakagawa et al., 2005). 세포 외 기질인 collagen은 피부재생, 주름개선 및 탄력과 같은 안티에이징에 효과적이다. 중간엽줄기세포(mesenchymal stem cells, MSCs) 자체의 효과 보다는 중간엽줄기세포가 분비하는 성장 인자와 같은 분비물에 의해 상처 치료가 유도됨을 보여주고 있다(Iso et al., 2007). 조건화 배지 내의 인자들을 보호하고 피부 침투를 용이하게 하기 위해 대부분 리포좀화 과정을 거쳐 화장품에 적용하고 있으며(Jang et al., 2005; Jukanti et al., 2011), 이는 화장품의 효과를 극대화 하기 위함이다. 리포좀화 공법이 적용된 지방줄기세포 조건화 배지는 화장품 원료로서 제형에 대한 제한이 없으며, 토너, 에센스, 크림 등의 기초화장품과 립스틱, 파운데이션 등과 같은 색조화장품 등 다양한 제품으로 만들 수 있다.
기존의 조건화배지 연구는 대부분 2차원 단층 배양에 대한 것으로 체내 환경과 상이하여 실제 환경을 반영하지 못하지만, 3차원 배양은 생체 내와 유사한 환경에서 세포를 배양시키는 방향으로 연구되고 있으며(Breslin & O'Driscoll, 2013), 세포치료제, 약물개발과정에서 기존의 동물 실험을 대체하여 약물 개발 스크리닝에 적용할 수 있는 방법으로 주목받고 있는데 이는 비용과 시간적 측면에서 높은 효율성을 보일 것으로 기대된다. 3차원 세포배양에는 다공성 고분자나 콜라젠, 아가로즈(agarose), 젤라틴(gelatin)등과 같은 천연 고분자 하이드로젤 등을 이용한 지지체 의존적 방법이 많이 사용되고 있으며, 지지체의 선택은 세포의 증식, 특성 유지에 매우 중요하다고 알려져 있다(Sachlos & Czernuszka, 2003). 최근 3차원 지지체를 이용한 세포배양법에 대한 연구개발이 활성화되어 비약적으로 기술이 발전하고 있으며, 3차원(3D) 줄기세포 조건화 배지는 바이오 화장품의 신원료로 각광받고 있고 있다(Kim et al., 2019). 선행연구를 통해 발표된 줄기세포 배양액의 임상적 효능을 살펴보면, 인체지방유래 줄기세포배양액 고분자 유화좀의 화장품 소재로서의 임상적 효용성에 관하여 연구하였으며(Kim et al., 2021), 3D 지방조직유래 중간엽줄기세포 배양액을 함유한 크림 타입 화장품은 피부노화 예방에 도움을 주는 것을 확인하였다(Kim et al., 2020).
국내외에서 줄기세포의 치료적 효용성에 관한 학술적 연구는 활발히 진행되고 있지만, 줄기세포배양액을 화장품 원료로 이용한 연구는 아직도 부족한 실정이다. 기존에 보고된 연구들 또한 세포실험, 동물실험을 통한 효능 검증이 대부분으로 인체적용시험을 통한 연구가 많이 부족하다. 특히, 생체 구조와 비슷한 환경에서 배양된 3차원(3D) 줄기세포 배양액을 함유한 화장품은 산업의 발전에 발맞추어 효용성 검증이 학술적 측면에서의 연구가 필요한 실정이다.
따라서 본 연구에서는 중간엽줄기세포 중 3차원 방식으로 배양된 지방조직유래 중간엽줄기세포의 조건화 배지와 이를 함유한 크림이 피부노화의 한 부분으로 알려진 탄력에 미치는 효능을 인체적용시험을 통해 증명하고자 하였다. 이를 통해 3차원 지방조직유래 중간엽줄기세포 조건화 배지가 함유된 크림이 피부탄력 저하를 예방하고 피부 탄력을 유지할 수 있다는 사실을 확인하며 바이오 화장품으로서의 가능성을 확인하고자 하였다.

Methods

Ⅰ. 세포 실험(in vitro)

1. 세포주 및 세포 배양

본 실험에 사용한 세포주는 20세 이하의 남성 포피조직 유래 human dermal fibroblast (HDF, 인간 진피유래 섬유아세포)와 human adipose tissue derived mesenchymal stem cell (ADMSC, 인간지방조직유래 중간엽줄기세포)를 CEFO Co. (Korea)에서 구매하여 사용하였다.

1) 인간 진피유래 섬유아세포

인간 진피유래 섬유아세포는 HDF 전용배지 (CEFO Co.)에 1% penicillin/streptomysin (ThermoFisher Scientific) (100 IU/50 µg/mL)을 첨가하여 37℃, 5% CO2 상대습도 95% 이상의 습윤 배양기에서 배양하였으며 2-3일에 한번 배지를 교환하였다. 계대 배양은 세포 접종 3-4일 후 실시하였다.

2) 3차원 방법(three dimensional method, 3D)의 지방 줄기세포 배양

생분해성 합성 바이오겔 Kolliphor®P 407 (BASF, Germany)을 멸균된 3차 증류수에 10% 농도로 녹여 겔을 제조한 후, 250 µL/cm2로 Transwell (Corning) 위에 도포하여 90 min 동안 37℃에서 굳혀 3차원 세포배양 환경을 만들었다. 그 후, 기존 배양 방법으로 배양 접시에서 배양한 인간 지방조직 유래 중간엽줄기세포를 미리 겔화를 진행한 생분해성 합성 바이오 겔 위에 접종하고 세포를 37℃, CO2 배양기에서 배양한 후 세포가 안정화된 1일 후 배양액을 교환하였다.

3) 인간 지방조직유래 중간엽줄기세포의 조건화 배지 확보

3차원 지방조직유래 중간엽줄기세포 조건화 배지(three-dimensional human adipose tissue derived mesenchymal stem cell conditioned medium, 3D ADMSC-CM) 확보 방법은 Kim et al. (2019)Kim et al. (2020)의 연구를 토대로 조건화 배지를 확보하였다.

2. 3D ADMSC-CM 크림 제조

메인 비커에 water phase를 투입하여 혼합하여 80℃까지 가온 된 water phase에 액상 유화제를 넣고 homogenizer를 이용하여 수화(80℃, 6,000 rpm, 10 min) 하였다. 별도의 비커에 투입한 oil phase를 80℃까지 가온 한 뒤, 메인 비커에 있는 water phase에 oil phase를 혼합하여 homogenizer로 유화(75℃, 6,000 rpm, 5 min) 하였다. Water phase와 oil phase가 혼합된 메인 비커를 45℃ 냉각화하였으며, 액상 유화제 캡슐을 별도의 비커에서 교반하여 캡슐화하였다. 메인 비커에 있는 water phase에 oil phase에 액상 유화제 캡슐을 투입하여 homogenizer를 이용하여 교반(45℃, 6,000 rpm, 3 min) 후, 메인 비커를 33℃까지 냉각하였다. 지방조직유래 3D ADMSC-CM은 1%가 함유된 크림제형으로 제조하였다.

3. 세포 독성 평가

세포생존율은 Ez-Cytox cell viability assay kit (DoGenBio, Korea)를 사용하였다. 먼저 HDF세포를 96 well plate에 2×104 cells/well의 농도로 접종하여 5% CO2, 37℃ 인큐베이터에서 24 h 동안 세포를 배양한다. 부착된 세포에 3D ADMSC-CM을 농도별로(0, 10, 30, 50%) 처리한 후 24 h 동안 배양하였다. 이후 과정은 제조사에서 제공된 Ez-Cytox 사용자 프로토콜에 따라서 진행하였다. 각 well에 EZ-Cytox 10 µL를 첨가하여 1 h 동안 인큐베이터에서 반응시킨 후 microplate reader (Molecular Device, USA)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하고 Folds값을 계산하였다.

4. 성장인자 분석

성장인자의 분석을 위해 3D ADMSC-CM과 일반적인 방법으로 배양하여 얻은 조건화 배지를 대조군으로 준비하였으며, 표피성장인자(epidermal growth factor, EGF; Human EGF Quantikine ELISA Kit)와 혈관내피성장인자(vascular endothelial growth factor VEGF; Human VEGF Quantikine ELISA Kit)는 R&D systems에서 구매하였으며 제조사에서 제공된 프로토콜에 따라 반응시킨 후 ELISA reader (Molecular Device)를 이용하여 450 nm에서 측정하고 pg/mL 값을 계산하였다.

5. 주름 관련 인자 발현 평가

피부주름에 역할을 하는 콜라겐(collagen 1) 유전자 발현 정도를 중합효소연쇄반응을 이용하여 확인하였다. 콜라겐(collagen 1)은 type 1 collagen을 합성하는 유전자로 인체에 존재하는 대표적인 섬유당 단백질인 collagen은 14개 type이 존재하는데 이 중 피부에는 type 1 collagen이 주로 존재한다(Uitto et al., 1989).
배양된 인간 진피유래 섬유아세포는 5×104개로 나누어 6-well plate에 분주하였고, 80% 이상 배양되었을 때 실험군을 각 well에 처리하여 24 h 동안 배양하였다. 이후, 세포 내의 total RNA를 RNA extraction kit (RNeasy mini kit, Qiagen, Germany)를 이용하여 추출하였고, 추출된 총 RNA는 RNA to cDNA EcoDryTM Premix (Oligo dT)(Clontech)를 이용하여 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA, Taqman Fast Advanced Master Mix (Applied Biosystems) 및 타겟의 Taqman primer (collagen 1: Hs00164004_ml; Applied Biosystems)를 이용하여 실시간 중합효소 연쇄반응을 진행하였으며, 각 유전자의 상대적인 정량 분석은 housekeeping gene인 GAPDH (Hs02786624_g1)을 이용하였다.
cDNA 증폭 시 실시간으로 증폭량을 확인하여 증폭 곡선과 역치선 사이의 교차점인 역치 사이클(cycle threshold, Cr) 값을 얻고 이 값을 토대로 상대 정량값(relative quantification, RQ)을 구하여 타겟 유전자의 상대적인 mRNA 발현량을 확인 할 수 있다. RQ는 아래의 식에 의해 계산한다.
RQ=2-ΔΔCr
ΔΔCT =ΔCT(treatment)-ΔCT(control)
ΔCT =CT(treatment)-CT(housekeeping gene)
Treatment (실험군): 시험제품 처리
Control (대조군): 음성대조군
Target gene: 콜라겐 (collagen 1)
Housekeeping gene: GAPDH

Ⅱ. 인체적용시험

3차원(3D) 지방조직유래 중간엽줄기세포 조건화 배양액을 함유한 크림의 유효성을 확인하기 위한 인체적용시험 연구는 연구윤리 심의가 확보된 연구이다(IRB-200828T001, P2010-1483).

1. 연구대상

본 연구 대상자는 만 20-60세의 여성을 대상으로 시험제품의 효능 검증의 진행하였다. 피부탄력 및 피부탄성복원력 연구대상자는 22명으로 사용 전, 사용 2주 후, 사용 4주 후를 측정하였으며, 리프팅 평가 연구대상자는 23명으로 사용 전, 사용 직후의 효능성을 평가하였다. 연구대상자는 실내온도 20-25℃, 습도 40-60%의 항온•항습 조건에서 30 min 간 대기한 다음에 측정하였다. 임상 대상자의 선정에 있어 화장품, 의약품 또는 일상적인 광 노출에 대한 반응이 심하거나 알러지가 있는 경우, 시험 참가 시점 3개월 이내에 면역억제제 치료를 받은 경우, 시험 참가 시점 1개월 이내에 전신 스테로이드 또는 광선 치료를 받은 경우, 시험부위에 병변이 있어 측정이 곤란한 경우, 아토피성 피부를 가진 경우의 여성은 제외하였다.

2. 피부탄력 및 피부탄성복원력 평가

탄력을 측정하는 장비인 Cutometer (MPA580; Courage+Khazaka electronic, Germany)는 지속적인 음압으로 측정 시간 동안 probe 속으로 피부가 빨려 들어간 뒤 음압이 제거되면 피부가 원래의 모습으로 돌아가는 원리를 이용하여 피부탄력을 측정하며 측정방법은 기기에 연결된 2 mm 직경의 probe를 피부에 밀착시켜 비침습적인 방법으로 측정한다. 본 시험에서는 측정조건으로 mode 1을 사용하며 일정하게 유지되는 450 mbar의 음압, suction time 2 s, relaxation time 2 s의 조건으로 연속 3번 측정한 뒤 산술평균을 구하여 측정결과를 얻었다. 피부탄력과 관련된 parameter는 R2 (gross elasticity), R5 (net elasticity), R7 (biological elasticity)이며 피부탄성복원력과 관련된 parameter는 R2, R5, R7, R8 (total recovery)이다.
- 탄력 변수(R2, R5, R7) 중 1개 이상의 측정값이 증가되면 피부 탄력이 개선되었다고 판단하였다.
- 탄력 변수(R2, R5, R7) 중 1개 이상의 측정값이 증가하고 R8값이 감소하면 피부탄성복원력이 증가함을 의미한다.
피부탄력 및 피부탄성복원력 변화율은 다음의 공식을 이용하여 구하였다.

1) R2, R5, R7값의 증가율(%)

((제품 적용 후 측정 값-제품 적용 전 측정 값)/제품 적용 전 측정값)×100

2) R8값의 감소율(%)

((제품 적용 후 측정 값-제품 적용 전 측정 값)/제품 적용 전 측정값)×100

3. 리프팅 평가

리프팅(좌 45°, 좌 30°, 정면(좌 0°, 우 0°), 우30°, 우 45°) 측정은 피부를 등고선으로 표현해 주는 기기인 F-ray (BEYOUNG Co. Ltd, Korea)를 사용하여 촬영하였다. 촬영한 이미지를 Image-pro® plus (Media Cybernetics, USA)로 분석하였다. 측정은 3D ADMSC-CM 크림 사용 전후에 동일한 좌측, 정면, 우측 볼 부위를 촬영하였고, 시험 부위 근처에 형성된 곡선을 기준으로 측정하였다. 좌측, 우측 볼 부위 리프팅 분석은 광대뼈 근처에 형성된 원을 기준으로 원 가운데서 직선을 그어 입가에 걸치는 직선과의 각도(°)를 재어 평가하였다. 정면 리프팅 분석은 눈꼬리와 콧볼에서 직선을 긋고, 눈 중앙에서 나오는 등고선과 콧볼에서 그은 직선의 접점에서 위로 일직선을 그어 콧볼 맞닿은 접점까지의 각도를 재어 평가하였다. 두 직선 간의 각도(°)가 작아질수록 리프팅 효과가 있음을 의미한다.

Ⅲ. 통계분석

본 시험의 주름 관련 인자 발현 통계 분석은 SPSS statistics 25.0 (IBM, USA) 프로그램을 이용하여 검증하였고, 실험군과 대조군의 유의성 여부를 가설 평균 차 5% (p<0.05)로 확인하였다. 피부탄력 및 피부탄성복원력 통계 분석은 SPSS statistics 26.0 프로그램을 이용하였고, 적용 전과 적용 후의 유의성 여부는 가설 평균 차 5% (p<0.05)로 확인하였으며, 리프팅 통계 분석은 시험 제품 사용 전 대비 측정값의 유의성 여부를 알아보기 위하여 통계분석 프로그램인 SPSS 19.0을 사용하였으며, 유의확률 p<0.05 일 때 유의성을 확인하였다.

Results and Discussion

1. 세포 증식능력 평가

인간 진피유래 섬유아세포(HDF)를 사용하여 3D ADMSC-CM의 세포 독성 여부를 평가하고자 하였다. 3D ADMSC-CM을 인간 진피유래 섬유아세포에 0, 10, 30, 50%의 농도로 처리한 후 EZ-CYTOX (WST) Assay를 이용하여 3D ADMSC-CM이 인간 진피유래 섬유아 세포에 미치는 영향을 분석하였다.
3차원(3D) 지방조직유래 중간엽줄기세포의 조건화 배지에 의한 세포 독성 평가 결과를 Figure 1에 나타냈다.
지방유래 중간엽줄기세포의 조건화배지가 인간 진피유래 섬유아세포에 미치는 영향을세포 형태에서도 확인하였다. 배양 24 h 동안에 인간 진피유래 섬유아세포는 스트레스나 세포 사멸에 의해 나타나는 형태적 변화가 관찰되지 않고 안정적이었으며(Figure 1A) 또한 cytotoxic assay에서도 모든 실험군에서 무독성으로 나타났다(Figure 1B). 오히려, 인간 진피유래 섬유아세포는 24 h 동안에 농도 의존적으로 세포의 생존율이 증가하는 것으로 나타났으며, 인간 진피유래 섬유아세포의 생존율을 대조군 평균을 1로 환산하였을 때, 10%의 농도에서 1.15배, 30%에서 1.51배, 50%에서 1.55배 증가되는 것으로 보아 3D ADMSC-CM는 세포 독성이 없으며 피부세포의 재생에도 우수한 소재임을 확인 할 수 있었다.
3D ADMSC-CM에 의한 세포의 성장률을 검증하기 위해 인간 진피유래 섬유아세포에서 3D ADMSC-CM을 50%의 농도로 1일, 3일, 5일 동안 처리 후 ADAM-MC를 통해 세포의 성장률을 확인한 결과, 기간별로 독성을 보이지 않았으며, 3D ADMSC-CM을 처리한 기간 동안 대조군 대비 16% 이상의 세포 성장에 효과가 있는 것으로 나타났다(Kim et al., 2019).

2. EGF, VEGF growth factor

인간 지방유래 중간엽줄기세포를 3차원 배양하여 만든 3D ADMSC-CM내 성장인자를 확인하고자 ELISA assay를 수행하였다. 성장인자 중 피부탄력에 영향하는 성장인자로 알려진 EGF와 VEGF의 발현량을 확인하였다(Figure 2).
3차원 배양된 지방유래 중간엽줄기세포(1×106 cells 기준)의 조건화 배지에서 EGF의 분비량은 2.692 pg/mL로 대조군 대비 1.85배 정도 더 많이 발현하였으며 VEGF의 경우는 27.89 pg/mL로 18.636 pg/mL인 대조군에 비해 약 1.5배 정도 더 높게 분비하였다.
EGF는 상피세포성장인자로 피부의 상피세포에 작용하는 노화로 인한 피부탄력, 주름을 완화시켜 효능이 있어 피부를 젊게 유지하는데 도움을 주며(Kang et al., 2019; Jeon et al., 2019), VEGF는 피부재생, 모발 재생과 성장에 도움을 준다(Mehta & Fitzpatrick, 2007)고 보고되어져 있다.
따라서, EGF와 VEGF가 일반적인 방식으로 만들어진 지방유래 중간엽줄기세포의 조건화배지보다 더 높은 농도로 함유되어 있어 피부 탄력 유지에 더 좋은 효과를 미칠 것으로 예상된다.

3. Collagen 단백질 발현량 측정

세포독성 평가를 통해 인간 진피유래 섬유아세포의 생존율이 80% 이상인 3D ADMSC-CM 크림의 처리 농도를 이용하였다. 3D ADMSC-CM 크림을 이용하여 인간 진피유래 섬유아세포가 만들어 내는 피부탄력에 역할을 하는 콜라겐(collagen 1)이 발현량을 측정하고자 하였다. 음성대조군으로는 인간 진피유래 섬유아세포에 특이적인 배지를 사용하였고 실험군은 3D ADMSC-CM크림을 24 h 동안 처리하여 콜라겐(collagen 1)의 발현을 확인하였다. 그 결과는 Figure 3과 같다.
인간 진피유래 섬유아세포에서, 콜라겐(collagen 1) 유전자는 대조군(control)과 비교했을 때, 3D ADMSC-CM 크림을 처리한 실험군에서 183% (약 1.83배)로 발현량이 증가하는 것을 확인 할 수 있었다. 3차원(3D) 세포배양 방식에 의해 제조된 지방유래 간엽줄기세포 조건화 배지는 인간 진피유래 섬유아세포에서 콜라겐과 같은 ECM의 발현이 증가하며(Kim et al., 2020), 지방유래 중간엽줄기세포가 분비하는 secretory factor에 의해 피부노화를 방지하는 효과가 있는 것으로 보고하고 있다(Park et al., 2008). 3D ADMSC-CM 크림은 피부탄력 관련 인자인 콜라겐(collagen 1)의 발현을 증가시키는 것을 확인 할 수 있었으며, 3D ADMSC-CM 크림이 피부탄력 예방에 도움을 줄 수 있을 것으로 기대된다.

4. 인체적용시험

젊음을 유지 또는 노화를 예방하기 위해 항노화에 대한 관심도가 증가하고 있다. 주름, 탄력, 리프팅 등에 의한 피부 변화에 따라 노화의 정도를 나눈다. 노화를 막는 것은 불가능 하지만 주름을 억제하고 탄력, 리프팅을 높여 노화를 늦추기 위해 많은 노력을 하고 있다. 이에 본 연구에서는 3D ADMSC-CM 크림이 리프팅, 피부탄력, 피부탄성복원력에 미치는 영향을 임상적 효용성을 통해 확인하였다.
본 연구에서 사용된 3D ADMSC-CM 크림에 대한 연구 대상자의 피부 이상반응 여부를 면밀히 관찰 후 임상적 효용성을 진행하였다. 3D ADMSC-CM 크림을 이용하여 연구 대상자들의 피부 이상 반응을 확인한 결과 피부 이상 반응이 발견되지 않았다고 보고되었다(Kim et al., 2019).

1) 리프팅 유효성 평가

3D ADMSC-CM 크림의 리프팅 효과를 평가하기 위해 사용 전, 사용 직후로 나누어 유효성 평가를 진행하였다. 객관적 측정을 위해 매 측정 시 동일한 시험 부위를 측정하였다.
3D ADMSC-CM 크림 사용에 의한 리프팅 효과를 측정하기 위해 사용 전후에 동일한 좌측, 정면, 우측 볼 부위를 촬영하였고, 시험 부위 근처에 형성된 곡선을 기준으로 측정된 리프팅 측정 값은 Table 1과 같다. 3D ADMSC-CM 크림 사용에 의한 정면(0°)에서 좌, 우측 볼 부위 각도의 변화를 확인하였다. 좌측(0°)에서 사용 전 19.358, 사용 직후 17.795로 8.074% 감소(p<0.05)되었으며, 우측(0°)에서 사용 전 18.250, 사용 직후 17.076으로 6.433% 감소(p<0.05)되는 것을 확인 할 수 있었다. 좌측(30°) 사용 전 33.493, 사용 직후 32.739로 2.251% 감소(p<0.05)되며, 우측(30°)에서 사용 전 31.556, 사용 직후 30.769로 2.494% 감소(p<0.05)하는 경향을 보였다. 좌측(45°) 사용 전 36.878, 사용 직후 36.028로 2.305% 감소(p<0.05)하였으며, 우측(45°) 사용 전 35.553, 사용 직후 34.602로 2.675% 유의하게 감소(p<0.05)하는 것으로 나타났다.
3D ADMSC-CM 크림을 1회 사용 후 리프팅 효과에 대한 이미지 분석은 Figure 4와 같다. 정면, 좌, 우측 30°, 좌, 우측 45°의 리프팅 이미지를 나타내고 있다. 시험 부위 근처에 형성된 곡선을 기준으로 측정하였으며, 실험 부위의 각도 변화를 확인할 수 있었다. 이와 같은 결과로 볼 때, 3D ADMSC-CM 크림은 리프팅에 도움을 주는 것으로 판단된다. 3D 지방조직유래 간엽줄기세포 조건화 배양액을 함유한 크림 타입 화장품이 피부 속 심측 탄력, 주름 개선 등에 영향을 미치는 것으로 보고되었다(Kim et al., 2020).

2) 피부탄력, 피부탄성복원력 평가

본 시험에서는 3D ADMSC-CM 크림이 피부탄력, 피부탄성복원력에 대한 결과를 측정하였다. 피부탄력 및 피부탄성복원력에 대한 개인별 개선율은 Table 2와 같다. 개체 내 대비 검정을 실시한 결과 R2값은 제품 적용 전에 비하여 적용 2주 후 및 적용 4주 후에 통계적으로 유의한 수준(p<0.01)으로 증가하였으며 각각 1.570%, 2.271%의 증가율을 나타냈다. R5값은 제품 적용 전에 비하여 적용 2주 후 및 적용 4주 후에 통계적으로 유의한 수준(p<0.001)으로 증가하였으며 각각 5.970%, 6.096%의 증가율을 나타냈다. 또한 R8값은 제품 적용 전에 비하여 적용 2주 후 및 적용 4주 후에 통계적으로 유의한 수준(p<0.005)으로 감소하였으며 각각 1.966%, 3.670%의 감소율을 나타냈다. Wilcoxon 순위 부호 검정을 실시한 결과 R7값은 제품 적용 전에 비하여 적용 2주 후 및 적용 4주 후 통계적으로 유의한 수준(p<0.0001)으로 증가하였으며 각각 5.786%, 6.133%의 증가율을 나타냈다.
피부탄력 및 피부탄성복원력에 대해 개선된 연구 대상자의 비율은 Table 3과 같다. 피부탄력 및 피부탄성복원력 변수 별 측정값이 개선된 연구 대상자의 비율을 분석한 결과 적용 2주 후 및 적용 4주 후 각각 90.909%. 95.455%의 연구 대상자가 R2값의 증가를 나타냈으며 적용 2주 후 및 적용 4주 후 모두 95.455%의 연구 대상자가 R5값의 증가를 나타냈으며 적용 2주 후 및 적용 4주 후 각각 90.909%, 100.000%의 연구 대상자가 R7값의 증가를 나타냈다. 또한 적용 2주 후 및 적용 4주 후 각각 72.727%, 90.909%의 연구 대상자가 R8값의 감소를 나타냈다.

Conclusion

본 연구는 3D ADMSC-CM의 화장품 원료로서 피부탄력에 영향을 미치는 성분을 세포생물학적 실험을 통해 확인하고, 3D ADMSC-CM이 함유된 크림이 피부탄력에 작용하는 임상적 효용성을 검증하고자 하였으며, 그 결과는 다음과 같다.
인간 진피유래 섬유아세포에 3D ADMSC-CM을 0, 10, 30, 50% 농도로 처리 한 후 세포독성을 확인하였다. 인간 진피유래 섬유아세포는 24시간 동안에 농도 의존적으로 대조군 대비 세포 생존율이 더 높아지는 것으로 보아 3D ADMSC-CM은 세포 독성이 없으며, 피부 세포의 재생에도 우수한 소재임을 확인 할 수 있었다. 3D ADMSC-CM내 피부탄력에 영향을 주는 것으로 알려진 EGF와 VEGF의 분비량을 확인하기 위하여 ELISA assay를 이용한 실험을 진행하였으며, 그 결과 일반적인 2차원 방식으로 만들어진 지방유래 중간엽줄기세포의 조건화배지보다 3D ADMSC-CM에서 EGF는 대조군 대비 약 1.85배, VEGF는 약 1.5배 정도 더 높게 분비하였다. 3차원 배양 방식을 적용한 경우에서 더 높은 농도의 EGF와 VEGF가 분비되는 것으로 보아 3D ADMSC-CM은 피부탄력 유지에 더 뛰어난 효과를 미칠 것으로 기대할 수 있다. 결과적으로 세포 생물학적 실험을 통해 3D ADMSC-CM는 진피세포의 세포생존력을 높이고 피부탄력에 영향하는 인자를 분비하는 것으로 세포생리학적 활성을 확인하였으며, 3D ADMSC-CM이 화장품 원료 물질로서의 가능성을 확인할 수 있었다.
임상적 유효성 평가에 앞서 3D ADMSC-CM 크림에 함유된 피부 탄력에 역할을 하는 콜라겐(collagen 1)의 발현량을 확인하고자 하였다. 그 결과 대조군(control) 대비 3D ADMSC-CM 크림을 처리한 실험군에서 183% (약 1.83배)로 발현량이 증가하는 것을 확인 할 수 있었으며, 3D ADMSC-CM을 함유한 크림이 피부탄력에 도움을 줄 수있을 것으로 예상된다. 다음으로 본 연구에서는 3D ADMSC-CM 크림이 피부탄력과 관련된 임상적 유효성에 미치는 영향에 관하여 검증하고자 하였다. 3D ADMSC-CM 크림에 의한 리프팅 유효성 평가를 측정하였다. 정면(0°)에서 좌, 우측 볼 부위 각도의 변화를 확인한 결과, 좌측(0°)에서 사용 전 19.358, 사용 직후 17.795로 8.074% 감소(p<0.05)되었으며, 우측(0°)에서 사용 전 18.250, 사용 직후 17.076으로 6.433% 감소(p<0.05)되는 것을 확인 할 수 있었다. 좌측(30°) 사용 전 33.493, 사용 직후 32.739로 2.251% 감소(p<0.05)되며, 우측(30°)에서 사용 전 31.556, 사용 직후 30.769로 2.494% 감소(p<0.05)하는 경향을 보였다. 좌측(45°) 사용 전 36.878, 사용 직후 36.028로 2.305% 감소(p<0.05)하였으며, 우측(45°) 사용 전 35.553, 사용 직후 34.602로 2.675% 유의하게 감소(p<0.05)하는 것으로 나타났다. 3D ADMSC-CM 크림에 의한 피부탄력 및 피부탄성복원력에 대한 개인별 개선율은 개체 내 대비 검정을 실시한 결과 R2값은 제품 적용 전에 비하여 적용 2주 후 및 적용 4주 후에 통계적으로 유의한 수준(p<0.01)으로 증가하였으며 각각 1.570%, 2.271%의 증가율을 나타냈다. R5값은 제품 적용 전에 비하여 적용 2주 후 및 적용 4주 후에 통계적으로 유의한 수준(p<0.001)으로 증가하였으며 각각 5.970%, 6.096%의 증가율을 나타냈다. 또한 R8값은 제품 적용 전에 비하여 적용 2주 후 및 적용 4주 후에 통계적으로 유의한 수준(p<0.005)으로 감소하였으며 각각 1.966%, 3.670%의 감소율을 나타냈다. Wilcoxon 순위 부호 검정을 실시한 결과 R7값은 제품 적용 전에 비하여 적용 2주 후 및 적용 4주 후 통계적으로 유의한 수준(p<0.0001)으로 증가하였으며 각각 5.786%, 6.133%의 증가율을 나타냈다. 3D ADMSC-CM 크림에 의한 피부탄력 및 피부탄성복원력 변수 별 측정값이 개선된 연구 대상자의 비율을 분석한 결과 적용 2주 후 및 적용 4주 후 각각 90.909%. 95.455%의 연구 대상자가 R2값의 증가를 나타냈으며 적용 2주 후 및 적용 4주 후 모두 95.455%의 연구 대상자가 R5값의 증가를 나타냈으며 적용 2주 후 및 적용 4주 후 각각 90.909%, 100.000%의 연구 대상자가 R7값의 증가를 나타냈다. 또한 적용 2주 후 및 적용 4주 후 각각 72.727%, 90.909%의 연구 대상자가 R8값의 감소를 나타냈다. 3D ADMSC-CM 크림은 피부 리프팅, 피부탄력, 피부탄성복원력 등 모든 항목에서 피부개선이 나타남을 확인 할 수 있었다.
이 연구를 통해, 인체 구조와 비슷한 환경에서 배양된 3D ADMSC-CM이 함유된 크림은 피부탄력에 대한 효능을 기대할 수 있으며, 더 나아가 피부 노화 예방에 도움을 줄 수 있을 것으로 기대된다. 결과적으로, 3D ADMSC-CM 크림은 코스메슈티컬 시장을 선도할 수 있는 신원료임을 검증하였다. 하지만, 3D ADMSC-CM 내의 탄력 성분 연구를 통해 어떠한 기전으로 피부탄력 개선에 영향을 주는지에 관한 추가적인 연구는 필요할 것으로 사료된다.

NOTES

Author's contribution
KHK, SL and SA designed this study together. KHK, SL and SB analyzed the data and wrote the manuscript. All authors read and confirmed the final version of manuscript.
Author details
Kyung Hye Kim (Ph.D. Student), Department of Cosmet ics Eng ineer ing, Konkuk Un ivers ity, 120 Neungdong-ro, Gwangjin-gu, Seoul 05029, Korea, (Deputy General Manager), Cosmeceutical Team, DongKoo Bio & Pharma, B-14F, 114, Beobwon-ro, Songpa-gu, Seoul 05854, Korea; Sunray Lee (Ph.D. & Vice Director), Stem Cell Niche Division, CEFO Research Center, 45-13 Ujeongguk-ro, Jongno-gu, Seoul 03150, Korea; Seunghee Bae (Professor), Department of Cosmetics Engineering, Konkuk University, 120 Neungdong-ro, Gwangjin-gu, Seoul 05029, Korea; Sungkwan An (Professor), Department of Cosmetics Engineering, Konkuk University, 120 Neungdong-ro, Gwangjin-gu, Seoul 05029, Korea.

Figure 1.

Effects of 3D ADMSC-CM on cell proliferation.

Human dermal fibroblast (HDF) cells were incubated with 3D ADMSC-CM (0%, 10%, 30%, and 50%) for 24 h, and cytotoxicity was measured by a WST-1 assay. All replicates (n=3) are displayed in the results graph. (A) Morphology and (B) effects after 3D ADMSC-CM treatment in HDF. 3D ADMSC-CM, three-dimensional human adipose tissue derived mesenchymal stem cell conditioned medium; HDF, human dermal fibroblast; WST-1, water-soluble tetrazolium salt.
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Figure 2.

Secretion of growth factors affecting skin elasticity in stem cell conditioned medium (control ADMSC-CM versus 3D ADMSC-CM).

The concentrations of EGF and VEGF among growth factors were compared in the conditioned medium of the three-dimensional method (3D ADMSC-CM) and the general method (control). Values represent M±S.D. of three independent experiments. *means compared to control. EGF, epidermal growth factor; VEGF, vascular endothelial growth factor; 3D ADMSC-CM, three-dimensional human adipose tissue derived mesenchymal stem cell conditioned medium;
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Figure 3.

Effects of 3D ADMSC-CM cream on the secretion of collagen 1.

The expression levels of collagen were measured (collagen 1) released by HDF when using the 3D ADMSC-CM cream; Collagen 1 plays a role in skin elasticity. Values represent M±S.D. of three independent experiments. *means compared to control. 3D ADMSC-CM, three-dimensional human adipose tissue derived mesenchymal stem cell conditioned medium.
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Figure 4.

Image analysis of the lifting effect of the 3D ADMSC-CM cream.

The lifting effect after using the 3D ADMSC-CM cream was measured once. Images of the same left, front, and right cheeks before and after using the test product were recorded, and the lifting effect was measured based on the curve formed near the test region. L, left; R, right.
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Table 1.
Results of skin lifting measurements
Before Right after use
L 0° 19.358±2.936 17.795±2.514*
L 30° 33.493±3.827 32.739±3.755*
L 45° 36.878±4.289 36.028±4.423*
R 0° 18.250±3.289 17.076±3.293*
R 30° 31.556±3.438 30.769±3.386*
R 45° 35.553±3.721 34.602±3.795*

* p <0.05;

L, Left; R, Right.

Table 2.
Mean of improvement rate (%) for each person by the variables of skin elasticity and skin resilience
2 weeks after application 4 weeks after application
R2 Increase rate 1.570 2.271*
R5 Increase rate 5.970 6.096*
R7 Increase rate 5.786 6.133*
R8 Decrease rate 1.966 3.670*

* p <0.05;

R2, gross elasticity; R5, net elasticity; R7, biological elasticity; R8, total recovery.

Table 3.
The rate (%) of subjects with improved skin elasticity and skin resilience by variables
2 weeks after application 4 weeks after application
R2 Increase rate 90.909 95.455*
R5 Increase rate 95.455 95.455*
R7 Increase rate 90.909 100.000*
R8 Decrease rate 72.727 90.909*

* p <0.05;

R2, gross elasticity; R5, net elasticity; R7, biological elasticity; R8, total recovery.

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