Introduction
현대 산업화 과정으로 인하여 환경이 변화함에 따라 피부염 즉 피부소양증의 발병이 증가하고 있다(Rang, 2013). 염증반응은 외부 자극에 대한 신체조직의 방어기작으로 외부로부터 발생한 물리적, 화학적 자극에 의한 신체 손상을 회복하려는 기전이다(Jung et al., 2015). 증상이 심한 피부소양증의 일차치료제로는 항염 효과가 있는 국소 코르티코스테로이드(topical corticosteroids) 제제를 사용할 수 있으나 부작용 등으로 장기간 사용이 불가하다. 그리하여 감마리놀렌산(gamma-linolenic acid)을 다량 함유하고 있는 식물성 오일이나 항알레르기, 염증완화의 효과가 있는 식물 정유를 함유한 제제들을 국소 도포하는 방법을 사용한다(Rang, 2013).
최근에는 웰빙(well-being) 및 로하스(lifestyles of health and sustainability, LOHAS)가 트렌드로 부상하고, 자연 친화적 환경에서의 건강한 삶을 추구함에 따라 천연물에서 유래된 기능성 화장품의 개발이 지속적으로 연구되고 있다. 그러나 국내의 향료자원에 대한 연구는 아직 미흡한 실정이다. 천연식물체에서 주로 얻을 수 있는 향료는 essential oil 또는 정유라고 알려진 방향성 물질들의 복합체로서 식물의 종, 부위, 산지에 따라 다른 독특한 향기를 나타내어 화장품이나 의약품, 식품 등 다양한 산업 분야에서 활용되고 있다(Ha, 2000).
식물에서 추출한 오일, 즉 정유의 향기성분은 코를 통해 후각 신경세포에 전달된 후 대뇌 변연계를 통해 직접적으로 두뇌에 전달되고, 자율신경계·내분비계·면역계 조절, 신체적 질병 치유에 영향을 준다. 또한 미네랄과 칼슘은 입을 통해 들어간 함량의 10%만 인체에 흡수되지만 정유를 피부에 바르면 85%까지 세포조직에 흡수되며, 분자구조가 미세하고 지방 물질에 쉽게 용해되는 지용성으로서 모공과 땀구멍에 흡수될 뿐만 아니라 피부 세포 사이로 침투하여 진피층까지 흡수된다는 보고가 있다(Youn et al., 2015).
미나리(Oenanthe javanica, OJ)는 독특한 향미 및 약리 작용으로 인해 기능성식품 소재나 향신료로 활용도가 높은 약용식물이다(Son et al., 2005). 주요성분인 isorhamnetin은 quercetin의 3’-O-methylated metabolite로서 항산화, 항증식, 항염, 항암 효능을 나타낸다(Jiang et al., 2006; Yang et al., 2013). 미나리의 항산화 활성에 관한 연구에는 미나리 에탄올 추출물(Hwang et al., 2011), 돌미나리 정유(Hwang et al., 2013) 등이 보고되었다.
깻잎(Perilla frutescens, PF)의 독특한 향미는 정유성분의 87%를 차지하는 Perillaldehyde와 limonene에 의한 것이고, DPPH, 3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-coenzyme A (HMG-CoA) reductase 및 angiotensin converting enzyme 저해 활성, malondialdehyde-bovine serum albumin (MDA-BSA) conjugation 억제 효과, 지질과산화 억제 효과, nitric oxide synthase (NOS) 저해 활성 및 peroxynitrite 소거능 등의 연구가 보고되고 있다(Hyun et al., 2003).
초피(Zanthoxylum piperitum, ZP)는 신미성분이나 향기가 있는 정유성분을 함유하고 있기 때문에 예로부터 중국에서는 초피(花椒), 계피, 회향, 진피, 정향 등의 오향 중에서 초피를 으뜸가는 향신료로 이용해왔고, 여러 가지 생리 활성 물질을 함유하고 있기 때문에 의약품으로서 방향성 건위, 소염, 이뇨, 구충제, 위하수증, 식욕증진, 신경통, 냉증, 저혈압, 지사제, 진해제, 중풍치료에 이르기까지 다양하게 이용되어 왔다(Kang et al., 2002). 초피 정유로는 식품, 천연보존제 활용 연구 및 향으로써의 연구가 많이 보고되고 있다(Cho et al., 2009; Draughon, 2004).
따라서 본 연구는 국내 자생 식물인 미나리, 깻잎, 초피 정유를 이용하여 향기성분을 분석하고, 항산화 효과와 RAW 264.7 대식세포에서 NO의 생성억제, 세포 독성 등을 연구하여 항염 효과를 확인함으로써 화장품 소재로서의 활용 가능성을 살펴보았다.
Methods
1. 시료 및 시약
본 실험에서 사용한 미나리는 전라남도 순천 가이아농장(Korea)에서 2016년 8월경 유기농으로 재배된 원물을 구입하였고, 깻잎은 한마음공동체 영농조합법인(Korea)에서 2016년 8월경 전라남도 장성에서 재배된 원물로 구입하였다. 구입한 원물은 깨끗이 수세한 후 일주일 동안 음지에서 자연 건조하였다. 초피는 ㈜세화당(Korea)에서 2016년 3월경 전라남도 광주에서 재배되어 건조된 상태의 원물을 구입하였다.
RAW 264.7 cell은 한국세포주은행(Korea)으로부터 분양 받아 사용하였고, Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM; Gibco®, Thermo Fisher Scientific, USA), Fetal Bovine Serum (FBS; Atlas Biologicals, USA), Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline without Calcium or Magnesium (DPBS; Lonza, Switzerland), lipopolysaccharide (LPS; Sigma-Aldrich, USA), DPPH (Sigma-Aldrich), Nitric Oxide Detection Kit (iNtRon Biotechnology, Korea), CellTiter 96® AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (Promega, USA)를 구입하여 실험에 사용하였다.
2. 정유 추출
미나리, 깻잎 및 초피의 정유는 수증기 증류 추출기(정유추출장치, EssenLab Plus; Hanil Lab Tech, Korea)를 이용하여 수증기 증류법으로 추출하였다. 수증기 증류 추출기의 수증기 발생부위에 3 L의 증류수를 넣고, 정유 발생부위에 시료 100 g을 넣은 후, 냉각관에서 4℃의 냉각수가 지속적으로 흘러 수용기에 모이도록 하였다. 수증기 발생부위의 온도를 110℃로 8 h 동안 유지시키면서 발생한 수증기가 정유 발생부위를 통과하면서 시료에 함유되어 있는 정유를 발생시켰다. 발생된 정유는 냉각관에서 응축된 수용기에서 증류수층과 정유층으로 분류되어 증류수층을 제거하였고, 미나리, 깻잎, 초피 정유는 성분 분석 시까지 4℃의 냉장고에서 보관하였다. 추출된 정유의 수율은 다음의 공식에 의하여 계산하였다.
Yield (%)=essential oils extractable content (mL)/dry weight of sample (g)×100
3. 정유의 향기성분 분석
추출된 정유의 향기성분은 1 μL의 정유를 1 mL methanol (Duksan Pure Chemicals, Korea)에 녹여 injector에 주입한 후 GC-MS로 분석하였다. GC는 Shimadzu GC-2010 (Shimadzu, Japan)을 사용하였으며, MS는 Shimadzu GCMS-QP2010 Plus (Shimadzu)를 사용하였다. GC와 MS의 작동조건은 Table 1에 나타내었으며 성분 분석은 Wiley 275 Library의 Mass Spectrum Data (Wiley, USA)를 이용하였다.
4. DPPH 라디칼 소거능 측정
항산화 측정은 DPPH 라디칼 소거활성으로 Blois (1958)의 방법을 변형하여, DPPH에 대한 수소전자 공여효과로 측정하였다. 96 well plate에 0.4 mM DPPH 용액 100 μL와 0.3, 0.6, 1.25, 2.5, 5% 농도별 시료 100 μL을 1:1로 혼합하여 실온에서 30 min 반응시킨 후, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) reader (SpectraMAX 190 Microplate Reader; Molecular Devices, USA)를 이용하여 517 nm 에서 흡광도(optical density, OD)를 측정하여 계산하였다. 양성대조군으로는 대표적 항산화 물질인 ascorbic acid (AA; Junsei, Japan)를 3 μg/mL 처리하였고, 음성대조군으로는 DPPH용액에 시료를 처리하지 않은 군으로 진행하였다. 3회 반복 실험을 통해 얻은 결과를 전자공여능(electron donating ability, EDA) 백분율로 나타내었다.
EDA (%)=(1-시료 처리군 흡광도)/시료 무처리군 흡광도×100
5. 세포 독성
마우스 대식세포 RAW 264.7는 10% FBS가 섞인 DMEM 배양액을 이용하여 37°C, 5% CO2 조건의 incubator (MC0175; Sanyo, Japan)에서 배양하였다. 세포에 대한 시료의 독성 여부를 확인하기 위해 CellTiter 96® AQueous One Solution Cell Proliferation Assay Kit를 사용하여 5-(3-caroboxymeth-oxyphenyl)-2H-tetrazolium inner salt (MTS) assay 방법으로 세포 독성을 측정하였다. RAW 264.7 세포를 96 well plate에 1×104 cells/mL 농도로 100 μL씩 분주한 후 24 h 배양하였다. 그런 다음, 시료를 0.01, 0.1, 1, 10, 20%의 농도가 되도록 세포배양배지로 희석하여 분주하고, 1 h 후 100 ng/mL LPS를 시료 처리군에 첨가하여 18 h 동안 반응을 유도하였다. 각 well의 배지를 제거하고, CellTiter 96® AQueous One Solution과 10% FBS를 포함한 DMEM을 2:8 비율로 희석하여 각 well에 80 μL씩 분주하였다. 37°C, 5% CO2 incubator 에서 4 h 동안 방치한 후, 490 nm에서 흡광도를 측정하였다. LPS와 시료를 모두 처리하지 않은 군을 대조군으로 하여 각 시료 처리군의 세포생존율을 확인하였으며, 실험결과는 3번 반복 측정치의 평균값으로 표시하였다.
Cell viability (%)=시료 처리군의 흡광도/대조군의 흡광도×100
6. NO생성 억제효과
RAW 264.7 세포에서의 항염 효과를 확인하기 위하여, 일산화질소(NO) 생산의 지표로서 배양 상층액 내에 안정된 NO 산화물인 이산화질소(nitrogen dioxide, NO2 )를 Griess reagent system을 이용하여 측정하였다(Murakami et al., 2000). RAW 264.7 세포를 10% FBS를 포함한 DMEM에 현탁시킨 후 96 well plate에 1×104 cells/mL 농도로 100 μL씩 분주하여 37°C, 5% CO2 incubator에서 24 h 배양하였다. 그런 다음, 시료를 0.01, 0.1, 1, 10%의 농도가 되도록 세포배양배지로 희석하여 분주하고, 1 h 후 100 ng/mL LPS를 시료 처리군에 첨가하여 18 h 동안 반응을 유도하였다. 새로운 96 well plate에 배양액 80 μL을 옮겨 담아, Nitric Oxide Detection Kit (iNtRon Biotechnology)를 이용하여 Substrate Solution Buffer 1 40 μL을 분주하고 10 min, Substrate Solution Buffer 2 40 μL를 분주하여 20 min 반응시킨 후 540 nm에서 흡광도를 측정한 다음 LPS만 처리한 대조군과 비교하여 나타내었다.
NO synthesis (%)=시료 처리군의 흡광도/대조군의 흡광도×100
Results and Discussion
1. 정유 추출
미나리, 깻잎, 초피의 수증기 증류 추출의 정유 수율은 각각 0.2%, 0.7%, 1.9%를 나타내었고(Table 2), 흰 민들레 에센셜오일 0.021%와 비교해서 상당히 높은 수율을 나타내었다(Im, 2012). 특히 초피는 단풍취, 갯기름 나물의 0.193%, 0.100% 와 비교해도 높은 수율임을 알 수 있었고(Chung et al., 2009), 제주산 로즈마리, 라벤더의 아로마 에센셜오일 2.15%, 1.38%과 비교해도 높은 수율을 보였다(Jeon et al., 2013).
2. 정유의 향기성분 분석
1) 미나리 정유 분석
수증기 증류법으로 추출한 미나리 정유의 향기성분은 Table 3과 같다. 그 중 β-caryophyllene (20.46%), δ-cadinene (14.46%), β-bisabolene (11.77%) 등이 대표적인 성분으로 분석되었으며, 미나리 정유에서는 주요 향기성분인 모노테르펜(monoterpene, C10) 6종, 세스퀴테르펜(sesquiterpene, C15) 5종이 포함되어 있었다. 특히 가장 많이 함유된 β-caryophyllene은 항염증, 항균 작용 및 종양세포주 억제 효과가 보고된 바가 있고(Choi, 2016), β-bisabolene의 경우 항균 활성, 항박테리아, 항암 활성, 항산화 활성 등이 보고되었다(Choi et al., 2009). 또한 β-pinene이 분석되었는데 이는 무색의 방향성 오일로 강한 솔나무 향을 나타내며, 로즈마리(rosemary), 파슬리(parsley), 바질(basil), 장미(rose) 등에서 주로 나타나는 성분으로 통증을 조절하고 항염 작용 등을 나타내는 것으로 보고되었다(Lim et al., 2008).
2) 깻잎 정유 분석
수증기 증류법으로 추출한 깻잎 정유의 향기성분은 Table 4와 같다. 그 중 α-pyrone (58.14%), β-caryophyllene (7.99%), β-farnesene (7.98%) 등이 대표적인 성분으로 분석되었으며, 깻잎 정유에서는 주요 향기성분인 모노테르펜 2종, 세스퀴테르펜 2종, 디테르펜(diterpene, C20) 1종이 함유되어 있었다. α-Pyrone은 통카콩(tonka bean)의 방향성분으로 알려져 있는 benzo-α-pyrone을 형성하기 위한 기본 화학구조물이다. β-Caryophyllene은 항염증, 항균 작용 및 종양세포주 억제 효과가 보고된 바가 있고, β-farnesene은 일랑일랑유, 생강, 국화 등에, α-humulen은 뽕나무과, 정향 등에 많이 함유되어 있는 향기성분이다(Amiel et al., 2012; Choi, 2016).
3) 초피 정유 분석
수증기 증류법으로 추출한 초피 정유의 향기성분은 Table 5와 같다. 초피의 주요 향기성분으로는 모노테르펜 8종이 포함되어 있고, 아세테이트(acetate) 성분도 4종이 확인되었다. 그 중dipentene (21.55%), β-citronellal (18.20%) 등이 대표적인 성분으로 분석되었는데, dipentene은 limonene의 유도체로서 비듬 등 곰팡이의 성장을 저해하는 항염 효과가 있으며(Lee & Lee, 2011), β-citronellal은 monoterpene 계열로서 강한 향균 작용을 나타내는 것으로 알려져 있다(Lim & Shin, 2009).
미나리, 깻잎, 초피 정유는 모노테르펜, 세스퀴테르펜 등의 향기성분을 다량 가지고 있고, 미나리 정유와 깻잎 정유의 β-caryophyllene, 초피 정유의 dipentene은 항염증, 항균의 억제 효과로 알려져 있다(Choi, 2016; Lee & Lee, 2011). 탄화수소계는 대부분 아로마 에센셜오일이 가지고 있는 성분으로 항균, 살균 작용이 있어 피부 가려움증으로 인한 증상완화, 염증완화 등의 기능성 화장품 원료로 사용 가능성이 높은 것으로 사료된다. 뿐만 아니라 미나리, 깻잎, 초피 정유의 공통적인 향기성분인 리날룰(linalool)은 라벤더오일의 주요 화학구성 성분으로서 진정 효과를 나타낸다. 이를 통해 추출된 정유의 향기흡입을 통해 육체적, 정신적, 심리적인 안정에 효과가 기대되는 바이다(Kim et al., 2014).
3. DPPH 라디칼 소거능 측정
전자공여능은 항산화 작용의 지표로 사용되고 있으며, 식물 정유의 항산화능 측정에는 DPPH 라디칼 소거능 측정법을 많이 이용하고 있다. 천연물의 라디칼 소거 활성은 인체 내에서 활성 라디칼에 의한 노화를 억제시키는 역할을 하고 있으며, 라디칼 소거 작용은 인체의 질병과 노화를 방지하는데 중요한 역할을 한다(Jo et al., 2014). 보라색의 DPPH가 항산화능을 가진 물질로부터 전자나 hydrogen radical을 받으면 환원되어 노란색으로 탈색되는데, 그 감소 정도를 ELISA reader (Molecular Devices)를 이용하여 517 nm에서의 흡광도로 측정하였다(Pak et al., 2016).
각 정유의 DPPH 소거능을 살펴본 결과는 Figure 1과 같다. 실험 결과, 각 정유별 EDA는 5% 미나리(91%), 5% 깻잎(72%)로 생산국 별 순수 라벤다 정유제품의 항산화력(Woo et al., 2010)보다 뛰어나고, 새덕이 잎 정유의 항산화 활성(Jeong et al., 2017)과 유사한 결과를 나타내었다. 초피 정유(26%)는 미나리와 깻잎보다는 EDA가 낮게 측정되었지만, 삼나무와 편백나무 정유의 항산화 효과(Kim et al., 2011), 서양민들레의 지상부, 지하부 에탄올추출물(Jung et al., 2015), 대추 품종별 성숙정도에 따른 항산화 활성(Park & Kim, 2016)보다 높은 EDA를 나타내었다. 이를 토대로 미나리 정유>깻잎 정유>초피 정유 순서의 EDA가 입증되었고, 본 연구에서 비교적으로 낮게 측정된 초피 정유도 여러 연구 논문을 토대로 비교 분석한 결과, 항산화 화장품 성분으로 충분한 사용 가능성이 확인되었다.
4. 세포 독성
MTS assay를 이용하여 항염 효과를 평가할 때 염증모델로 많이 사용하는 RAW 264.7 대식세포(Park, 2011)에 대한 세포 독성을 측정한 결과는 Figure 2와 같다. 미나리, 깻잎 정유 처리군에서는 LPS만 처리한 대조군과 비교하여 0.01–10% 농도에서 90% 이상의 세포생존율이 확인되었다. 특히 초피 정유는 0.01–10% 농도에서 세포 독성이 나타나지 않았을 뿐 아니라, 114.9±0.8%, 115.5±2.4%, 110.7±1.8%, 107.7±0.7%의 세포생존율이 나타나 오히려 세포증식을 촉진시키는 결과가 나타났다. 이 결과는 초피 정유에 대한 세포 독성의 결과(Jin et al., 2012)와 유사한 것으로, 세포증식 활성을 보유하고 있거나 외부자극원에 대한 일종의 방어기작으로서 세포증식이 활성화 되는 것으로 예측된다(Chan et al., 2011). 따라서 미나리, 깻잎, 초피 정유의 세포 독성을 나타낸 20%의 농도를 제외하고 독성을 나타내지 않는 안전한 농도인 0.01, 0.1, 1, 10%로 다음 실험을 수행하였다.
5. NO 생성 억제 효과
활성산소의 일종으로 최근 염증유발에 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 NO는 염증반응을 촉진하는 것으로 알려져 있으며, 활성조절은 염증반응을 조절하기 위한 핵심요소로 알려져 있다(Jang et al., 2016). NO는 NOS에 의해 L-arginine으로부터 생성되는데 특히 inducible NOS (iNOS)가 염증반응에 관여하며, tumor necrosis factor-α (TNFα), LPS와 같은 염증성 사이토카인(cytokine)의 자극이 있을 때 발현된다(Park & Jung, 2013). 또한 대식세포는 LPS의 자극에 의해 활성화되면 전염증성 인자의 조절을 통해 NO와 같은 염증반응의 매개물질 등을 생산 및 방출하게 된다. 이러한 사실을 근거로 LPS 자극에 의해 활성화된 RAW 264.7 세포 내에서 생성되는 NO에 대한 미나리, 깻잎, 초피 정유의 억제 효과를 측정하였으며(Jeong et al., 2017), 그 결과는 Figure 3와 같다.
LPS로 유도된 NO 생성량(100%)에 비해 각 정유의 NO 생성량은 10% 미나리 정유(78.4%), 10% 깻잎 정유(56.6%), 10% 초피 정유(29.0%)로 나타나, 초피 정유(71.0%), 깻잎 정유(43.4%), 미나리 정유(21.6%) 순으로 NO 억제 효과가 확인되었다. 초피 정유의 경우 제주 재래종 감귤 ‘홍귤’, ‘편귤’ 과피 분획물의 항염 활성에서 에틸아세테이트 분획물의 경우 100 μg/mL일 때 NO 생성 59.6% 억제(Hyun et al., 2015), 화장품 소재로서 가막살나무 추출물의 항염증 효능에서 헥산 및 메틸렌클로라이드 분획물에서 10 μg/mL일 때 NO 생성 50% 억제(Kwon et al., 2010), 찔레나무뿌리의 항염 효과에서 에탄올 추출물이 100 μg/mL일때 NO 생성 40% 억제(Park et al., 2011)보다 월등한 효과를 나타냈다. 또한 초피 정유보다 상대적으로 적은 NO 억제 효과를 보인 10% 미나리 정유는 잔대뿌리 에탄올 추출물 1 g/mL (NO 생성량 81.2%), 삼채뿌리 열수 추출물 250 μg/mL (NO 생성량 92.6%)보다 우수한 NO 억제력이 나타냈다(Lee et al., 2017). 10% 깻잎 정유는 곰마늘 에탄올 추출물 1 g/mL (NO 생성량 67.4%), 무 에탄올 추출물 1 g/mL (NO 생성량 63.4%)보다 약 7–10% 이상의 NO 억제 효과를 나타냈다(Lee et al., 2017). 이 같은 결과를 바탕으로 항염, 피부 가려움증의 기능성 화장품 원료로서 초피 정유의 활용가능성을 확인할 수 있었다.
Conclusion
미나리, 깻잎, 초피 정유를 GC-MS로 향기성분을 분석한 결과, 미나리와 초피에서는 항염 및 항균 효과가 있는 β-caryophyllene (20.46%), dipentene (21.55%)을 각각 대표적인 성분으로 함유하고 있었고, 깻잎에서는 주요 향료로 사용되는 α-pyrone (58.14%)이 확인되었다. 또한, 휘발성 향기성분인 리날룰이 공통적으로 나타나 스트레스에 지친 현대인들에게 아로마테라피의 흡입요법을 활용한 육체적, 정신적 안정 효과가 기대되었다.
추출 수율에 있어서도 산업적 활용이 가능한 높은 수율을 보였으며 특히, 초피는 1.9%로 국내 아로마 에센셜오일과도 비슷한 매우 높은 수준의 추출 수율을 나타내어 상품화의 가능성이 매우 클 것으로 생각된다.
DPPH 라디칼 소거능 결과에서 미나리가 5% 농도에서 91% EDA의 가장 우수한 항산화 효과를 나타냄을 확인하였고, 깻잎과 초피도 농도의존적으로 항산화 효과가 나타나 기능성 화장품으로서의 다양한 성분 활용성을 기대하게 하였다.
MTS assay를 통해 RAW 264.7 세포에서의 독성 여부를 확인하였는데, 대조군(LPS 및 시료 무처리군)의 생존율을 100%로 하였을 때 초피 정유의 경우 0.01–10% 농도에서 107.7% 이상의 세포생존율이 나타나 세포증식이 촉진되는 것으로 나타났다. 또한, 0.01–10% 농도에서 미나리와 깻잎 정유도 90% 이상의 세포생존율이 확인되어 세포 보호 효과가 있음을 알 수 있었다. NO assay를 통한 NO 생성 억제 효과에서도 초피 정유가 NO 생성 억제 능력이 뛰어났으며, 미나리와 깻잎도 농도범위 내에서 NO 생성을 억제하는 것으로 나타나 소양증, 염증완화를 위한 화장품 성분으로서 유효성을 입증하였다.
이상의 결과를 통해 미나리, 깻잎, 초피 정유는 향기분야로의 활용뿐만 아니라 항산화와 항염 효과가 우수하여 피부노화와 염증성 피부질환을 개선하고 세포재생을 유도하는 기능성 화장품의 소재로 사용될 수 있을 것으로 사료된다. 또한 이들 소재에 대한 지속적인 연구가 수행된다면 유효성분의 규명과 기전연구를 통해 화장품과 식품 그리고 임상분야에 있어서도 염증성 질환의 치료와 예방에 기여하는 효과적인 천연소재가 될 것이라 기대된다.
