Introduction
염증은 외부 자극원, 손상된 세포 및 박테리아 등을 포함한 유해한 생체 내외부 자극에 대한 면역 반응으로 알려져 있다(Albina & Reichner, 1995). 즉, 생명체의 세포 및 조직을 보호하기 위한 면역반응이지만 염증이 과도하게 유발되면 당뇨병, 고혈압, 아테로마성 동맥경화증, 암 및 신경 퇴행성 장애 등과 같은 질환 등을 통해 세포 및 조직 손상을 유도 할 수 있다고 알려져 있다(Albina & Reichner, 1995).
세균의 세포벽을 구성하고 있는 lipopolysaccharide (LPS)는 대식세포(macrophage)의 Toll-like receptor (TLR)에 결합하여 세포 내부 신호전달경로인 nuclear factor kappa beta (NFĸB)와 mitogen-activated protein kinase (MAPK) 신호의 활성화를 유도하고, prostaglandin E2 (PGE2), nitric oxide (NO)와 같은 염증성 매개인자를 분비하고 interleukin-1 (IL1), interleukin-6 (IL6), tumor necrosis factor-α (TNFα)와 같은 염증성 싸이토카인 분비를 증가시킨다(Akira & Takeda, 2004; Gomez et al., 2005). 대식세포는 면역 반응에서 여러 생물학적 과정에 중요한 역할을 하는 세포로써, 면역조절, 항원 제시, 식균작용과 같은 세 가지 주요 기능을 담당하며 이를 위해 다양한 싸이토카인 및 염증매개인자를 방출한다(Akira & Takeda, 2004; Gomez et al., 2005). 이렇게 생성된 염증 매개인자들은 주변세포를 보호하거나 면역기능을 강화시키는 중요한 역할을 하기도 하지만 과도한 NO와 PGE2 등은 염증을 악화시키는 원인이 되기도 한다(Kim et al., 2004). 특별히 NO는 염증의 대표적 지표물질로, 일반적으로 NO는 종양을 억제하거나 박테리아 등의 미생물을 죽이는 중요한 역할을 하지만 과도하게 생성된 NO는 유전적 변이, 조직손상 및 신경손상 등을 유발한다(Gabay, 2006; van Triel et al., 2010; Lee et al., 2014; Im, 2014). 또한 cyclooxygenase 2 (COX2)는 arachidonic acid을 염증매개물질인 prostaglandin E2 (PGE2)로 생성하는 효소로서 iNOS 등과 함께 염증반응에 중요한 유전자로 알려져 있다. LPS에 의해 대식세포가 활성화되면 NO와 PGE2는 의 생성이 증가되고 이는 IL1, 6 및 TNFα와 같은 염증성 싸이토카인 등을 생산한다(Horwood et al., 2006; Hirohashi & Morrison, 1996). 따라서 NO나 PGE2, 염증성 싸이토카인 등의 생성억제는 염증성 질환을 예방이나 치료에 있어 중요한 목표가 된다.
카로티노이드(carotenoids)는 널리 분포된 화합물의 일종으로 노란색, 오렌지색, 붉은색 등을 띄는 천연 색소의 일종이다. 이러한 색소들은 세균, 조류, 균류, 식물 등에 의해 합성되고 식품첨가물, 건강보조식품, 가금류 및 동물의 조사료 등으로 사용되고 있다. 카로티노이드는 강력한 항산화(Bartley & Scolnik, 1995; Kurihara et al., 2002) 및 항암효과(Mayne, 1996; Bertram et al., 2005), 면역기능 향상(Amar et al., 2004; Chew & Park, 2004) 등의 다양한 생물학적 효능을 지닌다고 알려져 있다. 특별히 파프리카, 사프란, 구기자 등의 녹황색 채소에 풍부하게 존재한다고 알려진 제아잔틴(zeaxanthin [(3R,3R)-β,β-carotene-3,3diol])은 크산토필(xanthophyll)의 일종으로, 눈 건강에 매우 효과적인 소재로 알려져 있고 눈건강 보조제의 첨가제로 사용되고 있다(Berry et al., 2003; Harker et al., 1998; Hannibal et al., 2000).
하지만 제아잔틴이 RAW264.7 세포주에서의 염증 완화에 효과적인지에 대한 연구는 보고된 바가 없다. 본 연구에서는 LPS에 의해 자극이 발생된 RAW264.7 세포주에 제아잔틴을 처리하였을 때의 항염증 효과를 확인하였다. 제아잔틴에 의한 RAW264.7 세포주의 생존률, 대식세포 표지유전자의 발현과 NO, PGE2 단백질 발현을 CCK-8 실험법, Real-time RT-PCR 및 ELISA 실험법으로 각각 확인하였다.
Methods
1. RAW264.7 세포주 배양
RAW264.7 대식세포주는 한국세포주은행(Korean Cell Line Bank, Korea)에서 구매하여 사용하였다. 소태아혈청(Fetal bovine serum; FBS, Welgene, Korea)과 penicillin/streptomycin (Invitrogen, USA)이 첨가된 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM; Gibco, USA)을 RAW264.7 대식세포주 배양에 사용했다. RAW264.7 대식세포주는 5 % CO2, 37℃, 100 % 습윤조건의 인큐베이터에서 배양하였다.
2. 세포 생존율 검증
제아잔틴(Cayman chemicals, USA)에 대한 세포의 생존율은 CCK-8 (Cell Counting Kit-8; Dojindo, Japan)를 사용하여 측정하였다. RAW264.7 대식세포주를 조직 배양 접시에 접종하고 24 h 동안 안정화 시킨 후, 제아잔틴을 농도 별로 24 h 처리하였다. 이후 phenol-red 무첨가 DMEM (Welgene)에 CCK-8 시약을 1:10의 비율로 희석하여 인큐베이터에서 30 min 동안 반응시켰다. Microplate reader (BioTek, USA)를 사용하여 450 nm 파장에서 흡광도를 측정하였고, 세포가 없는 배지를 대조군의 흡광도를 기초로 하여 세포 생존율을 계산하였다. 세포의 생존율은 대조군에 대한 백분율로 표시하였다.
3. 실시간 유전자 중합효소 연쇄반응(real-time RT-PCR)
Invitrogen의 TRIzol® Reagent (USA)를 사용하여 RAW264.7 대식세포주의 total RNA를 추출하였다. 추출한 RNA로부터 SuperiorScriptTM III reverse-transcriptase (Enzynomics, Korea)를 이용하여 cDNA를 합성하였으며, RAW264.7 대식세포주 표지인자의 발현양상을 확인하기 위하여 StepOnePlus real-time PCR machine (Applied Biosystems, USA)을 이용하여 real-time RT-PCR을 진행하였다. 실험에 사용된 Taqman® Gene expression assay (Applied Biosystems)는 Table 1에 명기하였다.
4. NO 정량
RAW264.7 대식세포주를 35 mm 조직 배양 접시에 20×104 cells로 접종하고 24 h 동안 안정화 시킨 후, 100 ng/mL 농도의 lipopolysaccharide (LPS; Sigma, USA)와 제아잔틴을 농도 별로 첨가하여 24 h 동안 배양 후, 상층액을 수집하여 원심분리한 후 상등액 100 μL를 이용하여 NO 생성량을 NO detection kit (iNtRON, Korea)를 사용하여 제조사의 프로토콜을 기반으로 측정하였다. 프로토콜을 간략히 요약하면, 100 μL 의 상등액에 50 μL의 N1 buffer를 첨가하여 10 min간 상온에서 반응시키고 N2 buffer를 50 μL 추가하여 10 min 간 추가로 반응시킨 후 ELISA reader로 520-560 nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다.
Results & Discussion
1. 제아잔틴의 농도 별 세포 생존율 분석
본 실험에 사용된 마우스 유래 대식세포주인 RAW264.7 대식세포주는, lipopolysaccharide (LPS)에 반응하여 염증반응이 나타나 염증성 싸이토카인을 방출하는 것으로 알려져 있다. 대식세포는 생체 전반에 분포하고 있으며 염증유발인자에 즉각적인 방어를 제공하는 면역세포로, 후천성 면역을 유도하는 항원제시세포로서의 역할과 다양한 싸이토카인을 분비하는 세포로 알려져 있다(Lawrence et al., 2002). 제아잔틴의 항염증 효과를 확인하기에 앞서, 연구에 사용하고자 하는 제아잔틴의 독성여부를 확인하기 위하여 CCK-8 assay로 세포의 생존률을 확인하였다. 대조군은 시료를 처리하지 않았고 제아잔틴은 100, 10, 1 μg/mL, 100, 10, 1, 0.1 ng/mL의 농도로 각각 처리하여 세포 생존율을 측정하였다(Figure 1). 100 μg/mL 농도 이상의 제아잔틴을 처리한 RAW264.7 대식세포주의 생존율이 유의성 있게 감소하였고, 10 μg/mL 이하의 농도에서는 RAW264.7 대식세포주의 생존율이 대조군과 유사하였기에 본 실험에서 진행되는 추가적인 실험은 10.1 μg/mL, 100 ng/mL의 제아잔틴을 처리하여 실험을 진행하였다.
2. 제아잔틴이 NO 생성에 미치는 영향
생체 내에서 NO는 혈압을 조절하거나, 종양과 세균을 제거하고 신호전달을 매개하는 등 다양한 역할을 담당하는 중요한 인자로 알려져 있다(Lee et al., 2014). 하지만 과도한 수준으로 생성되는 NO는 신경 등의 조직의 손상을 야기하고, 유전자의 변이를 유도하거나, 부종을 유발하는 등의 염증반응을 유도한다(Gabay, 2006; van Triel et al., 2010; Im, 2014). 본 실험에서 제아잔틴의 NO 감소 효과를 확인한 결과, LPS에 의해 11.5 μM 농도로 생성된 NO가 1 μg/mL의 제아잔틴을 처리하였을 때 5.8 μM로 나타나, LPS 처리군 대비 NO 생성이 유의성 있게 감소한 것으로 나타났다(Figure 2A).
LPS는 대식세포에서 inducible NO synthase (iNOS)라는 NO생성을 유도하는 효소를 촉진하여 NO의 생성을 증가시킨다(Namazi, 2004). 따라서 NO를 생성하는 효소인 iNOS 유전자 발현을 제아잔틴이 감소시키는지 확인하기 위하여 quantitative Real-time RT-PCR을 수행하였다. iNOS의 발현이 대조군 대비 LPS 처리군에서 현저히 증가하였으나, 1 μg/mL의 제아잔틴을 처리한 RAW 264.7 세포주에서는 LPS 처리군 대비 유의성 있게 감소함을 확인하였다(Figure 2B).
3. 제아잔틴이 PGE2의 생성에 미치는 영향
Prostaglandin (PG)는 arachidonic acid에서 유래된 불포화지방산으로 염증반응을 유도하는 호르몬으로 알려져 있다(Yun et al., 2008). PG의 한 종류인 PGE2는 염증반응을 매개하고, cyclooxygenase-2 (COX2) 효소에 의하여 생성된다. COX2 유전자가 과도하게 발현하거나 활성화된 경우에는 PGE2의 생성이 증가되어 통증, 발열 및 염증반응이 야기된다(Harris et al., 2002; Namazi, 2004). 제아잔틴의 항염 효능을 확인하기 위하여 제아잔틴의 PGE2 감소 여부를 확인한 결과, LPS 처리군에서는 PGE2의 생성이 19.5 μg/mL로, 대조군에 비해 현저히 증가하였다. 그에 반해 1 μg/ml의 제아잔틴을 처리하였을 때에는 PGE2의 생성이 6.3 μg/mL로 나타나 LPS 처리군과 비교하여 PGE2 생성이 현저히 감소하였다(Figure 3A). 또한 PGE2를 생성하는 효소인 COX2 유전자의 발현은 LPS 처리군에서 2.3배 증가하였으나 1 μg/mL의 제아잔틴을 처리한 세포주에서는 LPS 처리군 대비 42% 감소하였다(Figure 3B).
4. 제아잔틴이 염증성 싸이토카인의 생성에 미치는 영향
피부에의 만성적 염증은 피부의 노화 뿐만 아니라 피부질환을 야기할 수 있다(Noman et al., 2009; Shon et al., 2013; Lee et al., 2014). IL1α와 IL1β는 다양한 염증과정, 면역반응 및 조혈에 관여하는 싸이토카인으로, 대식세포와 면역반응이 유도된 형질세포 및 진피층내 섬유아세포 등에서 생성되는 염증의 강력한 매개체이다(Lord et al., 1991; Ban et al., 2011). 특히 IL1β는 염증부위에 호중구와 림프구 등의 염증세포의 침윤을 상승시키는 싸이토카인으로 잘 알려져 있다(Roitt et al., 2002; Baek et al., 2012). IL6는 형질세포의 분화와 성장을 유도하고, 알러지를 포함한 만성 염증성 질환을 유발한다고 보고되어 있다(Lee et al., 2014; Gabay, 2006). 또한, TNFα는 염증반응 초기에 염증부위로 호중구를 유도하여 급성 면역반응과 부종 및 발열을 유도하는 인자이다(Zhang et al., 1992).
LPS는 RAW 264.7대식세포주에서 인터류킨류와 iNOS, TNFα 등의 염증매개 인자의 생산을 촉진한다. 본 연구에서는 LPS (100 ng/mL)를 처리하여 RAW 264.7대식세포주의 염증반응을 유도한 후 제아잔틴의 염증성 싸이토카인 감소여부를 확인한 결과, IL1α는 LPS 처리군에 의해 8.5배 증가하였으나 10 μg/mL의 제아잔틴을 처리하였을 때 오히려 LPS 처리군 대비 84% 가량 발현이 증가하였고 1 μg/mL과 100 ng/mL의 제아잔틴을 처리한 세포군에서는 LPS 처리군 대비 IL1α 유전자의 발현을 감소시키지 못했다(Figure 4A). IL1β는 LPS 처리군에 의해 3.8배 증가하였으나 제아잔틴에 의한 유전자 발현은 감소하지 않았다(Figure 4B). IL6는 1 μg/mL 의 제아잔틴을 처리하였을 때 LPS 처리군에 비하여 36% 가량 발현이 감소하였다(Figure 4C). TNFα 는 제아잔틴 1 μg/mL 의 농도에서 LPS 처리군에 비해 43% 가량 발현이 감소하였다(Figure 4D). 본 연구에서 제아잔틴이 염증에 관여하는 전사인자 중 IL6 와 TNFα 의 발현을 억제시켰으며, NO와 PGE2 등의 생성 모두 1 μg/mL 농도의 제아잔틴 처리군에서 감소됨을 통하여 항염증 효과를 확인하였고, 피부노화 및 염증성 질환을 개선하는 치료제 또는 기능성 화장품 원료로서 제아잔틴을 활용할 수 있음을 보여주는 기초적인 자료가 될 것으로 보여진다. 특별히 Figure 2, 3와 Figure 4 C, D에서 1 μg/mL의 제아잔틴이 LPS에 의해 염증반응이 유도된 대식세포의 NO, PGE2, IL6, TNFα의 생성 및 발현을 특이적으로 감소시키는 농도라고 보여지며, 화장품 등의 조성에 적절히 활용할 수 있을 것이다. 10 μg/mL 농도의 제아잔틴에 의해 iNOS/COX2 유전자의 발현이 감소하지 않고 그에 의한 NO/PGE2 생성도 LPS 처리군과 비교하여 감소하지 않았다(Figure 2, 3). 그리고 IL1α, β 유전자의 발현은 오히려 10 μg/mL 농도의 제아잔틴 처리군에서 증가됨을 확인하였다(Figure 4A, B). 이는 CCK-8 assay를 통해서 10 μg/mL 농도의 제아잔틴이 세포생존율에 영향을 끼치지는 않지만 RAW264.7 세포주에 상당한 스트레스를 유발하는 농도로 여겨지며 소재로 사용될 시 적절한 농도를 배합하여 제품에 적용해야 할 필요성을 암시하고 있다.
Conclusion
피부는 노화에 의하여 탄력을 잃고 주름이 생성되며 두꺼워지고 염증 등의 증상이 난다. 자외선과 미세먼지, 세균 등과 같은 외부환경에 의해 피부는 활성산소종과 NO의 연쇄 반응을 통해 노화가 촉진되고 염증질환 등이 발생한다(Talwar et al., 1995; Kim et al., 2011). 또한 노화는 인체 내 존재하는 구성세포의 감소, 혹은 기능저하에 의해 정상적인 기능을 하는 조직으로의 재생 및 기능을 하지 못하게 된다(Kirkwood, 2005; Jones & Rando, 2011).
본 연구에서 제아잔틴을 RAW264.7 대식세포에 처리할 적절한 농도를 확인할 수 있었다. 10 μg/mL 이하의 농도에서는 RAW264.7 대식세포주의 생존율에 영향을 미치지 않음을 Figure 1을 통하여 확인하였다. iNOS, COX2, IL6와 TNFα의 유전자 발현양상 측정과 PGE2 단백질 발현 측정, NO 생성량 측정에서 제아잔틴이 유의성 있게 LPS에 의해 증가된 염증매개 인자의 발현이 회복되는 결과를 나타내었다(Figure 2-4). 이는 제아잔틴이 새로운 피부 염증개선 후보물질로서의 가능성을 보여준다.
제아잔틴의 피부의 염증을 개선할 수 있는 가능성을 확인한 연구는 본 연구가 최초로, 추후 피부미용 혹은 피부질환 치료제로서 실질적으로 활용될 수 있고, 염증에 의한 피부노화를 예방할 수 있는 가능성을 제시한 결과라 사료된다. 또한 향후 제아잔틴이 어떠한 세포내 기전으로 LPS에 의해 염증이 유발된 피부를 개선하는지에 대해 추가연구 및 임상연구가 필요할 것으로 사료된다.