본 실험에 사용된 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT), calcein, neocuproine, cupric sulfate, dimethylsulfoxide (DMSO) 그리고 vitamin C는 Sigma-Aldrich (USA)에서 구입하여 사용하였다. Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), antibiotics cocktail 그리고 bovine calf serum (BCS)은 Welgene Inc. (Daegu, Korea)에서 구입하여 사용하였다. RT-PCR 분석에 사용한 TRIzol^Ⓡ은 Life Technologies (Carlsbad, USA), PCR PreMix kit은 Bioneer (Daejeon, Korea)에서 구입하여 사용하였다. 본 실험에서 사용된 인간유래 HaCaT keratinocytes는 Cell Lines Service (CLS, Germany)에서 구입하여 사용하였다.

본 실험에 사용된 갈색거저리 유충(Tenebrio molitor larvae) 건조물(수분함량 3.3%)은 경상남도 농업기술원에서 제공받아 사용하였다. 갈색거저리 유충 건조물은 60℃의 온도에서 300 bar의 압력으로 초임계 추출기(SFX 3560, Lincoln, OR, USA)를 이용하여 3h 동안 갈색거저리 유충 오일(Tenebrio molitor larvae oil, TMO)을 추출하였다. 추출된 TMO는 이온교환수지 및 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 통해 불순물을 제거한 후 정제된 것을 -20℃에 보관하면서 이후 실험에 사용하였다.

갈색거저리 유충 오일 TMO의 항산화 활성은 DPPH 라디칼 소거활성을 이용하여 평가하였다. DPPH 라디칼 소거능은 Chen 등의 방법을 일부 변형하여 실험을 진행하였다(Chen et al., 1998). 190 μM의 DPPH에 0.01%, 0.05%, 0.1% 그리고 0.2% 농도의 TMO 10 μL를 가하여 37℃ 배양기에서 30 min 동안 반응시킨 후, microplate reader (VersaMax; Molecular Devices, USA)를 이용하여 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 본 실험에서는 수용성 항산화제인 Vitamin C (L-ascorbic acid)를 양성 대조군으로 사용하였다. TMO를 처리하지 않은 DPPH를 대조군으로 하여 TMO의 DPPH 라디칼 소거활성(% of control)을 계산하였다.

갈색거저리 유충 오일 TMO의 시료의 환원력은 Cu²⁺로부터 TMO에 의해 생성되는 Cu¹⁺이온의 양을 측정함으로써 분석하였다. 10 mM phosphate buffer (pH 7.4)에 용해시킨 100 μM CuCl₂ 용액 20 μL와 10 mM phosphate buffer에 용해시킨 250 μM neocuproine 80 μL를 혼합한 다음 0.01%, 0.05%, 0.1% 그리고 0.2%의 TMO를 각각 40 μL를 첨가하고 실온에서 1 h 동안 반응시킨 뒤 최종 반응액을 454 nm에서 흡광도를 측정하였다. TMO의 환원력은 Cu¹⁺/neocuproine의 extinction coefficient (7.95×10³ M^-1cm^-1)를 사용하여 흡광도로부터 계산된 Cu¹⁺의 농도로서 표시하였다.

갈색거저리 유충 오일 TMO의 metal chelating 활성은 2가 금속이온 형광센서로 잘 알려진 calcein을 이용하여 Argirova 등의 방법을 일부 변형하여 사용하였다(Argirova et al., 2003). 먼저 100 mL의 0.4 μM CuSO₄ 용액과 0.2 μM calcein을 잘 혼합한 후 혼합용액 100 μL에 0.01%, 0.05%, 0.1% 그리고 0.2%의 TMO 100 μL를 잘 섞어준 후 형광분석기에서 calcein의 형광 강도를 excitation wavelength 485 nm, emission wavelength 535 nm에서 측정하였다. CuSO₄를 첨가하지 않은 군을 대조군으로 하여 형광 강도(% of control)를 계산하였다.

갈색거저리 유충 오일 TMO의 세포독성을 알아보고자 MTT assay를 실시하였다. HaCaT keratinocytes에 TMO를 0.01, 0.05, 0.1, 그리고 0.2% (v/v)의 농도로 72 h 동안 처리한 후, MTT 시약을 DMEM 배지에 희석하여 200 μg/mL 농도로 제조하였다. 배지를 완전히 제거한 후 준비된 200 μg/mL의 MTT 희석액을 처리하여 37℃ CO₂ 배양기에서 1 h 동안 배양하였으며, 반응 후 배지를 완전히 제거하고 300 μL의 DMSO를 이용하여 각 세포의 불용성 formazan을 녹여주었다. DMSO에 녹인 formazan을 microplate reader를 이용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. TMO를 처리하지 않은 HaCaT 세포를 대조군으로 하여 TMO의 세포독성(% of control)을 평가하였다.

HaCaT keratinocytes에 72 h 동안 TMO를 0.01, 0.05, 그리고 0.1% (v/v)의 농도로 처리하고, Trizol^Ⓡ을 이용하여 total RNA를 추출한 후, chloroform을 100 μL씩 첨가하여 15 s 동안 잘 혼합하였다. 원심 분리기(1580R, Seoul, Korea)를 이용하여 16,500 rpm, 25 min의 조건에서 원심 분리하여 상층액을 얻은 후, 상층액에 250 μL isopropanol을 첨가하고 16,500 rpm에서 20 min 동안 재 원심 분리하여 mRNA를 분리하고 정량한 뒤 cDNA를 합성하였다. Thermal cycler (T100; Bio-Rad, USA)를 이용하여 합성된 cDNA로 PCR을 수행한 후 아가로즈 젤에 전기영동하여 유전자 발현수준을 분석하였다. 본 실험에서 사용된 대상 유전자들의 primer sequences는 Table 1과 같다.

본 연구의 결과는 평균±표준편차로 표현하였으며, 데이터의 통계처리는 Statistical Package for Social Science (SPSS, USA)를 이용하여 분석하였다. 사후검증은 Duncan's test (p<0.05) 또는 Student's t-test (p<0.05) 방법에 의하여 각 구간의 유의성 차이를 검증하였다.

DPPH 라디칼 소거능은 항산화 활성을 평가하는데 널리 이용되는 실험법이다(Lee et al., 2019). DPPH 라디컬 소거능에서 positive control로는 수용성 항산화제로 잘 알려진 비타민C (ascorbic acid)를 사용하였다. 비타민C는 0.05%의 농도에서 DPPH 라디칼을 44.96% 소거하였다. TMO는 0.01%, 0.05%, 0.1%, 그리고 0.2%의 농도에서 각각 4.77%, 17.04%, 25.60%, 그리고 36.87% DPPH 라디칼을 소거하였다. DPPH 라디칼을 50% 저해하는 농도인 TMO의 IC₅₀은 0.27%로 나타났다(Figure 1). 이전 연구들의 보고에 의하면 갈색거저리 유충 추출물의 DPPH 라디컬 소거 활성 및 아질산염 소거능이 보고되었다(Baek et al., 2017). 앞선 연구에서 갈색거저리 유충의 70% 에탄올 추출물이 사용되었으며, 1 mg/mL에서 17.22%, 5 mg/mL에서 66.79%, 10 mg/mL에서 81.17%의 DPPH radical 소거능을 나타냈다고 보고하였다. 본 연구에서는 갈색거저리 유충의 오일 성분만을 분리하여 직접적인 비교는 어렵지만 갈색거저리 유충의 단백질 및 지방 성분은 항산화 활성을 나타내는 것으로 추측된다. 갈색거저리 유충을 flavourzyme, alcalase, neutrase 단백가수분해 효소로 분해하였을 때 alcalase 가수분해물>flavourzyme 가수분해물>neutrase 가수분해물 순으로 DPPH 라디컬 소거활성이 높게 나타났다고 보고되었다(Yu et al., 2017). 지금까지 식용곤충과 관련된 연구는 곤충의 단백질 또는 펩타이드 구성 및 이들의 생리활성에 대한 연구가 대다수이며(Cho et al., 2020), 갈색거저리 유충의 오일 성분에 대한 연구는 상대적으로 미비한 실정이다. 건조된 갈색거지리 유충은 약 53%의 단백질, 28%의 지방 그리고 5%의 섬유소로 구성되어 있다고 알려져 있다 (Mariod, 2020). 현재 갈색거저리 유충의 단백질 성분은 활용되고 있는 방면 지방 성분은 대다수가 폐기되고 있는 실정이므로 이의 기능성이 체계적으로 검증된다면 갈색거저리 유충의 오일 성분 또한 기능성 소재로서 충분히 활용될 수 있을 것이라 생각된다. 본 결과는 갈색거저리 유충의 오일성분이 체내 활성산소의 증가를 억제를 통한 천연 항산화 소재로 활용될 수 있는 가능성을 시사한다.

갈색거저리 유충 오일 TMO의 전자공여능을 Cu²⁺ 이온을 TMO가 Cu¹⁺ 이온으로 환원시키는 능력을 측정하여 평가하였다. TMO의 환원력을 측정한 결과, TMO는 0.01%-0.2%에서 농도 의존적으로 환원력이 증가하였다. 0.01%, 0.05%, 0.1%, 그리고 0.2%의 TMO는 각각 6.88, 15.56, 20.25, 그리고 31.76으로 나타났다(Figure 2). 양성 대조군으로 사용된 0.01%의 비타민C는 54.62의 환원력을 나타냈다. 이전의 연구에서 상엽에 존재하는 flavonoids류의 일종인 flavonol이 환원력을 통한 전자공여를 통해 항산화 활성을 나타낸다고 보고 한 바 있으며(Kim & Jang, 2011), 환원력을 통한 전자공여는 항산화 활성의 주요한 작용기전 중 하나라 알려져 있다(Huang et al., 2005). 따라서 갈색거저리 유충 오일 TMO는 hydroxyl 라디컬(HO•) 등의 활성산소를 전자공여능을 통해 안정화시키는데 기여할 수 있으며, 향후 이너뷰티 및 화장품 개발에 있어 항산화 소재로 충분히 활용될 수 있을 것이라 생각된다.

갈색거저리 유충 오일 TMO의 metal chelating은 calcein을 이용한 형광분석법을 이용하였다. 항산화 소재의 metal chelating 활성은 H₂O₂와 2가 전이금속과의 반응 (Fenton-like reaction)에 의해 생성되는 유리 라디칼의 생성을 억제 또는 차단할 수 있는 지의 가능성을 보여준다. TMO의 metal chelating 활성을 측정한 결과, 0.01%, 0.05%, 0.1% 그리고 0.2%의 TMO는 농도 의존적으로 Cu²⁺ 이온에 대한 metal chelating 활성이 증가하였다. 0.01%, 0.05%, 0.1% 그리고 0.2%의 TMO는 대조군 대비 각각 16.56%, 22.08%, 40.41% 그리고 60.86%로 나타났다(Figure 3). 2가 전이금속의 metal chelating로 잘 알려진 100 μM의 O-phenanthroline (OP)의 metal chelating 활성은 대조군 대비 80.06%로 나타났다. 항산화 소재로 잘 알려진 quercetin, kaempferol, rutin 및 luteolin의 항산화 활성에 있어 metal chelating이 중요하게 작용한다고 기 보고된바 있으며(Leopoldini et al., 2006; Brown et al., 1998), HepG2 세포에서 kaempferol의 metal chelating은 세포의 nuclear factor erythroid-2-related factor 2 (Nrf2)를 상향 조절하여 세포내 항산화 활성을 증진시킨다고 보고되었다(Kim et al., 2012). 본 연구에서 TMO의 항산화 활성은 환원력과 metal chelating 활성이 복합적으로 작용하는 것으로 추측된다.

TMO가 HaCaT keratinocytes에서 독성을 나타내는지 알아보기 위하여 MTT assay를 실시하여 세포생존율을 분석하였다. TMO를 0.01%, 0.05%, 0.1% 그리고 0.2%의 농도로 HaCaT 세포에 72h 처리하였을 때, TMO를 처리한 HaCaT 세포의 생존율은 각각 105.23%, 106.10%, 100.55% 그리고 100.07%였다(Figure 4). 결과적으로 0.2% 이하의 TMO 처리는 HaCaT 세포에서 유의적인 세포독성을 나타내지 않았으므로, 이후 실험에서는 0.01%-0.2% 농도의 TMO를 사용하였다.

HaCaT keratinocytes에서 TMO를 72 h 처리한 후 ceramide synthase와 ceramidase의 유전자 발현을 분석하였다. 그 결과, TMO를 0.01%, 0.05%, 0.1% 그리고 0.2% 처리하였을 때 대조군의 HaCaT 세포와 비교하여 ceramide synthase의 mRNA 발현수준이 현저히 증가한 것을 확인하였으며, 반대로 ceramidase의 발현은 농도 의존적으로 감소하는 것을 확인하였다(Figure 5).

피지막의 지질 성분 중 ceramide의 생성 감소는 표피장벽을 파괴하고 이는 수용성자연 보습인자의 감소를 유발하며 결과적으로 표피 수분의 손실을 증가시킨다. 따라서, ceramide의 생성과 감소는 피부의 보습에 중요한 영향을 미친다. 피부의 충분한 수분량은 피부의 표면을 매끄럽게 하고 탄력의 유지 및 피부결을 좌우하는 중요한 요소이다. 건강한 표피의 각질층은 15-20%의 수분을 함유하고 있으며 수분이 10% 이하로 떨어지면 피부가 건조해지고 윤기와 탄력이 없어져 주름을 증가시킨다(Elam et al., 1963).

피부의 ceramide는 ceramidase에 의해 sphingosine과 지방산으로 최종 분해되고 이들 분해 산물은 ceramide synthase에 의해 다시 ceramide로 전환될 수도 있다. Ceramide는 ceramide synthase에 의해 sphingosine과 지방산을 이용하여 합성되며, ceramide의의 생성은 또한 serine palmitoyltransferase, cerebrosidase, 그리고 sphingomyelinase 등의 효소에 의해 촉진된다 (Mizutani et al., 2009). 반대로 ceramide는 ceramidase에 의해 sphingosin과 지방산으로 분해되며 glucosylceramide synthase 그리고 sphingomyelin synthase 등에 의해 영향을 받는다 (Mizutani et al., 2009). 이전의 연구에서 ceramidase가 결핍된 Acer1^-/- 마우스의 피부에서 높은 수준의 ceramide 함량이 관찰된 것을 볼 때 ceramidase의 억제는 피부의 ceramide 증가를 통해 피부의 보습유지에 도움이 될 수 있다는 것을 뜻한다(Liakath-Ali et al., 2016). Ceramide의 함량을 조절하는 두 효소의 활성 및 직접적인 피부의 보습 개선 정도를 측정하는 것이 더 바람직하나, 현재는 식용곤충에서 분리한 오일의 보습소재로서의 가능성을 스크리닝 하는 초기 단계이기 때문에 향후 해당 부분에 대한 추가실험이 요구된다. 위의 결과는 피부의 각질세포에서 TMO가 ceramide의 생성 및 유지에 도움을 줄 수 있는 소재로서의 가능성을 보여주는 결과로 생각된다.