HPLC Analysis of <i>Achyranthes fauriei</i> and Comparison of Curves for 20-Hydroxyecdysone and 25S-Inokosterone

Lee, Joon Han; Kim, Do Hyeong; Ahn, Jin Jung; Yang, Byung wook; Joon Han Lee; Do Hyeong Kim; Jin Jung Ahn; Byung wook Yang

doi:10.20402/ajbc.2024.0051

Asian J Beauty Cosmetol > Volume 22(4); 2024 > Article

우슬의 HPLC분석과 20-Hydroxyecdysone 및 25S-Inokosterone의 검량 곡선 비교

Research Article

Asian J Beauty Cosmetol 2024; 22(4): 541-552.

Published online: December 16, 2024

DOI: https://doi.org/10.20402/ajbc.2024.0051

우슬의 HPLC분석과 20-Hydroxyecdysone 및 25S-Inokosterone의 검량 곡선 비교

이준한¹, 김도형², 안진정^3,^*, 양병욱^1,^*

¹세명대학교 보건바이오대학 바이오제약산업학부, 충청북도 제천시, 한국

²세명대학교 보건바이오대학 한방식품영양학과, 충청북도 제천시, 한국

³세명대학교 보건바이오대학 뷰티케어학과, 충청북도 제천시, 한국

HPLC Analysis of Achyranthes fauriei and Comparison of Curves for 20-Hydroxyecdysone and 25S-Inokosterone

Joon Han Lee¹, Do Hyeong Kim², Jin Jung Ahn^3,^*, Byung wook Yang^1,^*

¹School of Industrial Bio-Pharmaceutical Science, College of Health & Biotechnology, Semyung University, Jecheon-si, Chungcheongbuk-do, Korea

²Department of Oriental Medical Food & Nutrition, College of Health & Biotechnology Semyung University, Jecheon-si, Chungcheongbuk-do, Korea

³Department of Beauty Care, College of Health & Biotechnology, Semyung University, Jecheon-si, Chungcheongbuk-do, Korea

牛膝的HPLC分析以及20-羟基蜕皮酮和25S-肌诺酮曲线比较

李俊翰¹, 金度亨², 安晉廷^3,^*, 梁秉旭^1,^*

¹世明大学保健生物大学化妆品美容学部化妆品科学科，忠清北道堤川市，韩国

²世明大学保健生物大学韩方食品营养学科，忠清北道堤川市，韩国

³世明大学保健生物大学美容学科，忠清北道堤川市，韩国

^*Corresponding author: Byung Wook Yang, School of Industrial Bio-Pharmaceutical Science, College of Health & Biotechnology, Semyung University, 65 Semyung-ro, Jecheon-si, Chungcheongbuk-do 27136, Korea Tel.: +82 43 649 1416 Email: bwyang@semyung.ac.kr

^*Corresponding author: Jin Jung Ahn, Department of Beauty Care, College of Health & Biotechnology, Semyung University, Semyung University, 65 Semyung-ro, Jecheon-si, Chungcheongbuk-do 27136, Korea Tel.: +82 43 649 1637 Email: grace@semyung.ac.kr

Received July 22, 2024 Revised November 12, 2024 Accepted November 15, 2024

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요약

목적

본 연구는 기능성 원료로서의 우슬의 생리적 활성 능력과 주요성분의 함량을 분석하여, 우슬의 기능성 원료로서의 가능성을 탐색하고자 하였다.

방법

DPPH 및 ABTS 실험을 통해 라디칼 소거 활성을 분석하였고, 우슬 추출물의 총 폴리페놀 및 총 플라보노이드 함량을 분석하였다. HPLC 분석을 통해 시료 내 각 성분의 농도를 정밀하게 측정하고 정량 분석을 위해 표준 물질 20-hydroxyecdysone와 25S-inokosterone를 두 화합물의 검량을 비교 분석하였다.

결과

Achyranthes fauriei 뿌리 추출물의 DPPH 라디칼 제거 활성 실험 결과 AFR-100 E>AFR-50 E>AFR-D.W. 순으로 농도 의존적으로 증가하였다. ABTS 분석결과 AFR-50 E>AFR-100 E>AFR-D.W. 순으로 농도 의존적으로 높아졌다. 총 폴리페놀 함량의 결과는 AFR-100 E>AFR-50 E>AFR-D.W. 순이었으며, 총 플라보노이드 함량 AFR-100 E>AFR-50 E>AFR-D.W. 순이었다. HPLC 분석결과 20-hydroxyecdysone는 AFR-50 E 샘플에서 가장 높은 농도를, 25S-inokosterone는 AFR-100 E 샘플에서 가장 높은 농도를 보였다.

결론

본 우슬의 in vitro 실험을 통해 20-hydroxyecdysone와 25S-inokosterone 검량분석결과, 두 그래프 모두 상관계수가 매우 높아 농도가 클수록 데이터의 선형 관계가 크며, 플라보노이드 함량이 크게 증가할 수 있음을 확인하였다. 본 연구 결과 우슬의 뿌리가 항산화와 항염 효과가 뛰어난 천연 화합물인 플라보노이드를 다량 포함하고 있음을 확인하였으며, 우슬의 우수한 정량분석 방법을 제시하였다.

핵심용어: 우슬, HPLC, DPPH, 폴리페놀, 플라보노이드

Abstract

Purpose

The purpose of this study was to determine the potential of Achyranthes fauriei as a functional ingredient by analyzing its physiological activity and identifying its main components.

Methods

Radical scavenging activity was analyzed by 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) and 2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid (ABTS) assays. Total polyphenol and flavonoid content in A. fauriei root extracts were measured. The concentrations of each component in the samples were measured by HPLC. For quantitative analysis, the standard substances, 20-hydroxyecdysone and 25S-inokosterone, were used to compare and analyze the calibration of these two compounds.

Results

The DPPH radical scavenging activity of Achyranthes fauriei root extracts was increased in the order AFR-100 E>AFR-50 E>AFR-D.W., based on their concentration. The ABTS assay revealed an increase in the order AFR-50 E>AFR-100 E>AFR-D.W., based on concentration. The total polyphenol content was in the order AFR-100 E>AFR-50 E>AFR-D.W.; total flavonoid content followed the same trend. HPLC analysis revealed that 20-hydroxyecdysone had the highest concentration in the AFR-50 E sample, whereas 25S-inokosterone had the highest concentration in the AFR-100 E sample.

Conclusion

Based on in vitro studies of the A. fauriei root, a calibration analysis of 20-hydroxyecdysone and 25S-inokosterone revealed very high correlation coefficients, indicating a strong linear relationship as concentration increased, with a significant increase in flavonoid content. The results indicate that A. fauriei root contains a high number of flavonoids, which are natural compounds exhibiting excellent antioxidant and anti-inflammatory effects. We also established a robust quantitative analysis method for A. fauriei.

Keywords: Achyranthes fauriei, HPLC, DPPH, Polyphenol, Flavonoid

中文摘要

目的

通过分析牛膝的生理活性并鉴定其主要成分，以确定牛膝作为功能成分的潜力。

方法

通过DPPH和ABTS实验分析自由基清除活性，并分析牛膝提取物的总多酚和总黄酮含量。通过HPLC分析，精确测定样品中各成分的浓度，并采用标准物质20-羟基蜕皮酮和25S-肌酮进行定量分析，对两种化合物的校准进行比较分析。

结果

牛膝根提取物的DPPH自由基清除活性根据其浓度按 AFR-100 E>AFR-50 E>AFR-D.W.的顺序增加。ABTS 测定显示，根据浓度AFR-50 E>AFR-100 E>AFR-D.W.的顺序增加。总多酚含量顺序为AFR-100 E>AFR-50 E>AFR-D.W.；总黄酮含量也呈现同样的趋势。HPLC分析显示，20-羟基蜕皮酮在AFR-50 E样品中浓度最高，而25S-肌诺酮在AFR-100 E样品中浓度最高。

结论

基于对牛膝根的体外研究，20-羟基蜕皮酮和25S-肌睾酮的校准分析显示出非常高的相关系数，表明随着浓度的增加呈很强的线性关系，黄酮类化合物含量显着增加。结果表明，牛膝根含有大量黄酮类化合物，它们是具有优异抗氧化和抗炎作用的天然化合物，并提出了一种优良的植物定量分析方法。

关键词: 牛膝, HPLC, DPPH, 多酚, 类黄酮

Introduction

최근 몇 년간 건강에 대한 트렌드는 개인의 웰빙을 중심으로 다양한 형태로 발전하고 있으며, 전통적인 건강 관리 방식에서 벗어나 더욱 포괄적이고 맞춤형 접근법으로 진화하고 있다. 현대인들에게 있어 건강은 ‘헬시 에이징(healthy aging)’이라고 하는 단순히 오래 사는 것보다 건강하게 오래 사는 것이 중요하다고 생각한다. 이러한 라이프스타일은 건강한 노화를 가져오는 운동, 영양, 정신 건강 관리 등을 통해 젊음을 유지하고 노화를 늦추려는 시도와 관련된 헬시 에이징 산업분야를 발전하도록 하였다. 이로 인해 사람들은 식물성, 친환경, 기능성 제품을 선호하는 경향이 높아지고 있으며 건강기능식 품의 일종으로 각종 식물 추출물의 기능성 원료로서의 생리기능성 연구가 이루어지고 있다. 본 논문은 기능성 원료로서의 우슬의 항산화 활성 능력과 주요 성분의 함량을 분석하여, 우슬의 기능성 원료로서의 가능성을 탐색하고, 향후 연구 방향을 제시하고자 한다.

우슬은 쇠무릎속, 비름과에 속하는 다년생 식물로 한국, 일본, 중국에 분포한다. 우슬은 국가마다 기원 식물이 달라 국내의 경우 토우슬(Achyranthes Japonica Nakai), 중국에서는 회우슬(Achyranthes Bidentata Blume) 등을 사용하고 있다(Um, 2021). 우슬의 뿌리는 원기둥모양의 원뿌리에 가늘고 긴 측근이 많이 붙어있으며 길이 5-0 cm, 지름 3-5 mm이다. 뿌리의 윗부분에는 줄기가 짤막하게 남아있다. 바깥면은 회색 빛을 띤 노란색에서 연한 노란색이다. 질은 단단하나 쉽게 꺾이며 꺾인 면은 각질이고 황백색이나 황갈색이다. 약간 특유한 냄새가 있고 맛은 약간 달며 점성이 있다.

우슬은 고관절염 개선 및 혈행 개선과 통증 조절을 위한 치료에 사용되고 있는 식물로 inocoterone, oleanolic acid, saponin, ecdysone, β-sitosterol, daucosterol, ecdysterone 등의 성분을 함유하고 있다(Kim & Park, 2010). 우슬은 한방에서 구어혈, 통경, 이뇨, 관절통의 개선 등의 목적으로 사용하는데 월경불순과 악혈(惡血)을 제거하는 요약으로 요슬, 관절의 어통, 마비, 수종, 요불리(尿不利)에 응용한다. 특히, 임산부는 낙태위험이 있어 사용을 피해야 한다(Kim et al., 2012a).

이를 바탕으로 본 연구에서는 용매 별 털쇠무릎뿌리 추출물의 기능성 소재로서의 가능성을 탐색하여 100% 에탄올 추출물, 50% 에탄올 추출물, 물 추출물을 제조하여 다양한 용매 변화에 따른 추출물의 항산화 활성 차이 및 Achyrantes fauriei root의 유효성분인 20-hydroxyecdysone와 25S-inokosterone의 함량을 기준으로 비교 분석하고자 한다. 20-hydroxyecdysone와 25S-inokosterone은 모두 에크디손(ecdysteroids)류 화합물로 정밀한 정량 분석을 가능하게 한다. 이 두 물질은 곤충과 식물에서 중요한 역할을 하는 스테로이드 계열 물질로 이들은 구조적으로 유사하지만 미세한 차이가 있으며, HPLC 분석을 통해 이들 물질의 농도와 순도를 비교함으로써, 두 물질의 상대적 농도와 비율을 파악하거나 제품의 효능과 안전성 평가할 때 또는 추출물의 품질을 평가할 때 생물학적 활성 차이를 정량화 할 수 있게 한다.

식물에서의 에크디손류는 자연 방어 기작에 중요한 보호기능을 하지만, 에크디스테로이드가 포함된 식물을 섭취하면 근육 성장, 항산화 효과, 대사 촉진 등의 건강 증진 효과를 가져올 수 있다는 연구들이 보고되고 있으며, 천연 항산화제인 flavonoid와 polyphenol 등은 산화적 스트레스로부터 신경세포 보호효과가 뛰어나며, 상호작용으로 인하여 reactive oxygen species (ROS)에 대한 생체 방어시스템을 지속적으로 유지할 수 있게 한다(Yoo & Kim, 2023).

천연물에 기능성 성분을 추출하기 위해 용매 추출 및 초음파 등 추출조건에 따라 유효성분이 달라지기 때문에 목표 물질의 분리 및 설정을 위해 HPLC 공정의 최적화는 필수적이다라고 볼 수 있으며(Lee et al, 2024), 본 연구에서는 우슬의 항산화 활성을 연구하고 HPLC에서의 추출 조건의 최적화를 위해 20-hydroxyecdysone와 25S-inokosterone의 두개의 표준 품을 이용하여 비교 분석하고자 한다.

본 연구를 통해 향후 천연물 관련 연구 및 산업적 활용에 대한 기초 연구자료와 방향성을 제시하고, 기능성 소재로서의 가능성과 이를 기반으로 한 천연물 산업의 활용 방안을 모색하는데 연구의 목적이 있다.

Methods

1. Sample preparation

본 실험에 사용한 시료는 털쇠무릎뿌리(Achyranthes fauriei root, 우슬) 100% 국내산으로 두손애약초에서 구매하였으며, Kim & Park (2010)에서 우슬 추출물 제조방법을 참고하여, 분말 형태인 털쇠무릎 뿌리 10 g을 추출 용매(100% 에탄올, 50% 에탄올, 증류수) 250 mL에 60℃에서 2 h 추출하고 추출한 것을 여과한 후, 여과물에 다시 250 mL의 추출 용매를 가해 추출하였다. 본 과정을 3회 반복하여 얻은 각 1-3차 추출물을 혼합하고 회전감압농축기(EYELA N-1300; Tokyo Rikakikai Co., Japan)를 이용하여 감압 농축한 후 동결건조기에 48-72 h 동안 동결 건조하여 분말로 조제 후 시료로 사용하였다(Figure 1).

2. Statistical processing

모든 실험은 3회 측정을 통해 얻은 평균값 과 편차로 나타내었으며, Student’s t-test를 통해 p<0.05일 경우 실험값에 대한 통계적 유의성 있는 결과로 판단하였다.

3. In vitro assay

1) ABTS 라디칼 소거 활성

ABTS 자유라디칼 소거 활성은 ascorbic acid를 positive control로 사용하였고, Lee & Ahn (2022)의 연구방법을 참고하여 ABTS 정량 계산하였다. Ascorbic acid (Sigma-Aldrich, USA)를 positive control로 사용하였다. ABTS (Tokyo Chemical Industr, Japan) 용액 7 mM과 2.45 mM potassium persulfate (Sigma-Aldrich)를 1:1의 비율로 혼합한 뒤 암실에서 16시간 반응시킨 후 ABTS 라디칼을 형성시켜 희석된 ABTS 용액을 에탄올로 희석하여 734 nm에서 측정한 흡광도 값이 0.70±0.02가 되도록 조정하였다. 그 후 ABTS 용액 0.9 mL에 Achyranthes fauriei root의 용매 별 추출물 0.1 mL를 혼합하여 암실에서 6 min간 방치한 다음 Synergy HTX Multi-Mode Microplate Reader (BioTek, USA)를 사용하여 734 nm에서 흡광도를 측정하였다.

2) DPPH 라디칼 소거 활성

DPPH 자유라디칼 소거활성은 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (Sigma-Aldrich)를 이용하여 시료의 라디칼 소거효과(radical scavenging effect)를 측정하는 Blois법(Blois, 1958)을 활용하였고, Kim et al.(2012b)의 실험 방법을 참고하여 진행하였다. 각 용매별 추출물을 농도별(1, 2, 2.5, 5 mg/mL)로 제조한 시료 0.2 mL에 0.2 mM DPPH 0.6 mL를 가하고 vortex mixing 후 실온에서 15 min간 반응시킨 후 분광 광도계를 이용하여 517 nm에서 흡광도를 측정하여 DPPH의 환원에 의한 흡광도 감소를 조사하였고, 무처리구와 처리구의 값을 비교하여 free 라디칼 소거활성을 결정하였다. 기존의 항산화제인 ascorbic acid (Sigma-Aldrich)를 대조구로 사용하여 비교하였다.

3) 총 polyphenol 함량 측정

총 폴리페놀의 함량은 Folin & Ciocalteau’s phenol reagent (Sigma-Aldrich)을 사용하여 측정하였다(Lee et al., 2011). 이 방법은 항산화제의 환원 능력을 측정하는 전자 전달을 기반으로 하는 항산화 분석법으로, 1 mg/mL의 검색시료 100 μL와 Folin & Ciocalteau’s phenol reagent 50 μL를 혼합하여 5 min간 반응시켰다. 20% (w/v) sodium carbonate 300 μL를 혼합하여 15분 후에 증류수 1 mL를 첨가한 다음 Synergy HTX Multi-Mode Microplate Reader (BioTek, USA)를 이용해 725 nm에서 흡광도를 측정하였다. 총 폴리페놀 함량은 tannic acid (Sigma-Aldrich)를 이용하여 작성한 표준검량선으로 계산하였다.

4) 총 flavonoid 함량 측정

총 플라보노이드 함량 측정은 Jung et al.(2022)의 방법을 일부 수정하여 측정하였다. 시료 원액 10 μL와 5% sodium nitrite (Daejung, Korea) 30 μL, 증류수 200 μL를 진탕한 후 5 min간 실온에서 반응시키고 10% aluminum chloride (Samchun, Korea) 30 μL를 대체해 혼합하 여 6분간 실온에서 반응시킨 뒤 1 M sodium hydroxide (Duksan, Korea) 200 μL와 증류수 240 μL를 혼합하여 SynergyTM HTX Multi-Mode Microplate Reader (BioTek, USA)를 이용해 420 nm에서 흡광도를 측정하였으며 tannic acid (Sigma-Aldrich)를 이용하여 표준곡선으로부터 총 플라보노이드 함량을 산출하였다.

5) HPLC analysis

본 연구에 사용된 high performance liquid chromatograph (HPLC) system은 Agilent 1260 infinity Ⅱ (USA) 시리즈 제품으로, 1260 infinity Ⅱ pump, Agilent 1260 infinity autosampler, Agilent 1260 infinity Ⅱ UVD로 구성되어 있다.

분석에 사용된 컬럼은 CAPCELL PAK (250*4.6 mm, 5 μm, product of Japan)을 사용하였고, 유속은 1.0 mL/min, 주입량은 10 μL, 컬럼 온도는 실온에서 측정, UV detector 254 nm에서 측정하였다. 이동상 조성으로는 0.1% 인산(phosphoric acid, Daejung, Korea)과 아세토니트릴(acetonitrile, Honeywell Burdick & Jackson, USA)의 혼합물을 사용하였고 gradient elution방법으로 재현성이 높게 설정하였으며, 정량분석과 동일성 확인 정밀성과 정확성을 위해 식약처로부터 제공받은 표준품 20-hydroxyecdysone와 25S-inokosterone을 사용하였다.

Results and Discussion

1. Extraction results by solvent

세가지 용매를 이용하여 Achyranthes fauriei 뿌리 추출물의 추출 수율(%)은 50% 에탄올을 사용한 경우가 50.60±1.638%로 가장 높은 수율을 보였으며, 증류수 47.92±4.541%, 100% 에탄올을 사용한 경우에는 가장 낮은 수율(25.00±0.799%)을 보여 50% 에탄올이 가장 효과적인 수율로 나타났다. 실험을 반복하여 정확성을 높였으며, 50% 에탄올에서 평균 50.60%의 수율 ±1.638% 범위 내에서 변동성까지 확인하였다(Table 1).

2. DPPH radical scavenging activity

Achyranthes fauriei 뿌리 추출물의 DPPH 라디칼 소거 활성 실험 결과, 100% 에탄올을 사용한 Achyranthes fauriei 뿌리 추출물(AFR-100 E), 50% 에탄올을 사용한 Achyranthes fauriei 뿌리 추출물(AFR-50 E), 증류수를 사용한 Achyranthes fauriei 뿌리 추출물(AFR-D.W.)의 값은 AFR-100 E>AFR-50 E>AFR-D.W. 순으로 농도 의존적으로 증가하였다(Figure 2).

이 결과는 Lee et al. (2014)의 국내산 토우슬과 중국산 회우슬 비교실험에서 토우슬 및 회우슬의 분획물에서 모두 ethylacetate 분획에서 강력한 DPPH scavenging activity (DSA) 및 ABTS scavenging activity (ASA)를 나타내고, 나머지 분획물의 항산화 활성은 미미하다고 보고한 연구결과와 일치하였다.

3. ABTS radical scavenging activity

양성 대조군 L-ascorbic acid 1 mg/mL를 사용하여 ABTS 실험결과, 100% 에탄올을 사용한 Achyranthes fauriei 뿌리 추출물(AFR-100 E), 50% 에탄올을 사용한 Achyranthes fauriei 뿌리 추출물(AFR-50 E), 증류수를 사용한 Achyranthes fauriei 뿌리 추출물(AFR-D.W.)의 값은 AFR-50 E>AFR-100 E>AFR-D.W. 순으로 농도 의존적으로 높아졌다(Figure 3). 이 결과는 DPPH 연구결과에서 언급되었던 Lee et al.(2014) 연구에서 국내산 토우슬 ethylacetate 분획물 ASA의 경우 0.5 mg/mL 농도에서 vitamin C (0.01 mg/mL)에 필적하는 강력한 활성을 나타낸 보고와 일치하였다.

4. Total polyphenol content

용매 별 Achyranthes fauriei 뿌리 추출물의 총 폴리페놀 함량의 결과는 AFR-100 E>AFR-50 E>AFR-D.W. 순이었으며, Achyranthes fauriei 뿌리에서 폴리페놀 함량을 최대화하려면 100% 에탄올을 사용하는 것이 가장 효과적이며, 50% 에탄올도 유효하였다. 증류수는 상대적으로 낮은 추출 효율을 보였다(Figure 4).

상관분석 결과, 탄닌산(tannic acid) 농도(g/mL)에 따른 흡광도(725 nm) 회귀분석 결과 탄닌산 농도가 증가함에 따라 흡광도가 증가하였으며, 상관계수 값이 0.9997로 매우 높은 값을 가지고 있으며(y=0.0041x+0.052), 탄닌산이 1 g/mL 증가할 때마다 흡광도가 약 0.0041만큼 증가하였다. 탄닌산 농도와 흡광도 사이의 신뢰도가 높음을 확인하였다(Figure 5). 이 연구결과는 우슬의 증숙에 따른 항산화능을 연구한 Kim et al. (2018)의 연구와 우슬의 비가열 초음파추출, 환류추출 및 열처리 초음파추출을 비교 실험한 Jang et al. (2012) 논문에서 증류수에서는 낮은 함량을 보인 연구결과와 일치하였다.

5. Total flavonoid content

용매 별 Achyranthes fauriei 뿌리 추출물의 총 플라보노이드 함량 AFR-100 E>AFR-50 E>AFR-D.W. 순이었으며, AFR-100 E: 100% 에탄올로 추출한 경우, 총 플라보노이드 함량은 약 12 mg TAE/g로 가장 높았다. AFR-50 E: 50% 에탄올로 추출한 경우, 총 플라보노이드 함량은 약 9 mg TAE/g, AFR-D.W.: 증류수로 추출한 경우, 총 플라보노이드 함량은 약 5 mg TAE/g로 가장 낮았다. 따라서 Achyranthes fauriei 뿌리에서 플라보노이드 함량을 최대화 하려면 100% 에탄올을 사용하는 것이 가장 효과적임을 확인하였다(Figure 6).

상관분석 결과, 탄닌산(tannic acid) 농도(g/mL)에 따른 흡광도(420 nm) 회귀분석 결과 탄닌산 농도가 증가함에 따라 흡광도가 증가하였으며, 상관계수 값이 0.9992로 높은 값을 가지고 있으며(y=0.0006x+0.0438), 탄닌산이 1 g/mL 증가할 때마다 흡광도가 약 0.0006만큼 증가하였다. 탄닌산 농도와 흡광도 사이의 신뢰도가 높음을 확인하였다(Figure 7). 이는 폴리페놀 함량, 플라보노이드 함량 및 항산화 활성실험에서 가열처리 시에 우슬만이 환원력의 커다란 증가를 나타냈다고 보고한 Jang et al.(2012)의 논문의 결과와 일치하였으며, 가열처리에 의한 항산화 활성 물질의 증가로 인해 환원력 또한 증가되어진 것으로 판단된다.

6. HPLC contents analysis

고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 사용하여 20-hydroxyecdysone과 25S-inokosterone을 분석한 결과, 20 min 근처에서 20-hydroxyecdysone, 25 min 근처에서 25S-inokosterone가 나타났다. 두 피크 모두 비교적 높은 신호 강도를 가지고 있으며, 두 화합물의 함량이 높을 것을 보아 우슬의 생리학적 효과와 응용 가능성을 기대할 수 있다(Figure 8).

각 시료 샘플 별 표준물질(20-hydroxyecdysone, 25S-inokosterone)에서의 분석결과는 AFR-100 E와 AFR-50 E 두 샘플 모두 20-hydroxyecdysone과 25S-inokosterone의 피크를 나타냈으나 AFR-D.W.에서는 피크가 나타나지 않거나 매우 미약하였으며, 각 피크의 높이와 면적을 통해 화합물의 함량을 예측할 수 있음을 확인하였다(Figure 9).

20-hydroxyecdysone와 25S-inokosterone에서의 농도 비교 결과, 20-hydroxyecdysone에서는 AFR-50 E에서 가장 높은 함량(0.092%)을 보였고, 그 다음으로 AFR-100 E (0.087%), AFR-D.W. 샘플에서는 상대적으로 낮은 함량(0.052%)이 측정되었다. 25S-inokosterone에서는 AFR-100 E 샘플에서 가장 높은 함량(0.027%)를 보이고, 그 다음으로 AFR-50 E 샘플(0.023%), AFR-D.W. 샘플에서는 가장 낮은 함량(0.015%)이 관찰되었다. 20-hydroxyecdysone는 AFR-50 E 샘플에서 가장 높은 함량을, 25S-inokosterone는 AFR-100 E 샘플에서 가장 높은 함량을 보이고 있으며, 두 화합물 모두에서 AFR-D.W. 샘플은 가장 낮은 함량을 나타내어, 비교된 다른 샘플들보다 상대적으로 적은 양을 포함하고 있음을 확인하였다(Figure 10).

20-hydroxyecdysone과 25S-inokosterone의 농도와 흡광도 사이의 상관관계분석결과 20-hydroxyecdysone에서 R² : 0.9999, 25S-inokosterone에서 R² : 0.9997를 나타냈다. 두 표준물질 모두 기울기가 비슷하지만 25S-inokosterone의 기울기가 약간 더 큰데, 이는 25S-inokosterone의 농도가 동일한 변화량일 때 20-hydroxyecdysone보다 약간 더 높은 흡광도를 나타냄을 의미한다. 두 그래프 모두 상관계수가 매우 높아 농도가 클수록 데이터의 선형관계가 크며 플라보노이드와의 함량이 크게 증가할 수 있음을 확인하였다(Figure 11). Lee et al. (2020)의 논문에서 증류수 추출물, 70% 주정 추출물, 100% 주정 추출물 순으로 폴리페놀과 플라보노이드 함량이 높게 나온 연구결과가 보고 되었지만, 본 연구에서는 Achyranthes fauriei 뿌리 추출물의 추출 수율(%)은 50% 에탄올을 사용한 경우가 50.60±1.638%로 가장 높은 수율을 보였다. 이는 뿌리와 줄기에서의 함량 추출 부위로 인한 차이로 보인다.

Conclusion

본 연구는 기능성 원료로서의 우슬의 생리적 활성 능력과 주요 성분의 함량을 분석하여 우슬의 가능성을 탐색하고자 하였다. 이를 위해, 먼저 DPPH 및 ABTS 실험을 통해 우슬의 라디칼 소거 활성을 분석하여 항산화 능력을 검증하였다. 다음으로 우슬 추출물의 총 폴리페놀 및 총 플라보노이드 함량을 분석하여 기능성을 평가하고, 다양한 천연물 관련 산업적 응용 가능성을 제시하고 정량적 분석 방법에 대해 제시하고자 하였다.

페놀류가 열에 민감한 생리활성 물질이므로 온도를 조절하여 추출할 수 있고, 화합물의 안정성을 유지하는 데 유리한 환류추출(reflux extraction)을 통해 시료를 추출하였고, HPLC 분석을 통해 시료 내 각 성분의 농도를 정밀하게 측정하고, 정량 분석을 위해 표준물질인 20-hydroxyecdysone과 25S-inokosterone을 사용하여 두 화합물의 검량검증을 비교 분석하였다.

그 결과, Achyranthes fauriei 뿌리 추출물의 DPPH 라디칼 소거 활성 실험 결과 AFR-100 E>AFR-50 E>AFR-D.W. 순으로 농도 의존적으로 증가하였다. ABTS 분석결과 AFR-50 E>AFR-100 E>AFR-D.W. 순으로 농도 의존적으로 높아졌다. 총 폴리페놀 함량의 결과는 AFR-100 E>AFR-50 E>AFR-D.W. 순이었으며, 총 플라보노이드 함량 AFR-100 E>AFR-50 E>AFR-D.W. 순이었다. HPLC 분석결과 20-hydroxyecdysone는 AFR-50 E 샘플에서 가장 높은 농도를, 25S-inokosterone는 AFR-100 E 샘플에서 가장 높은 농도를 보였다.

20-hydroxyecdysone과 25S-inokosterone 두 물질은 이성질체로 MS 스펙트럼만으 로는 두 물질을 동정할 수는 없으나 우슬의 지표 성분은 두 개의 피크에서 각각 20 분경, 28 분경으로 기록되었으며, HPLC 크로마토그램과 UV 스펙트럼을 비교한 결과, 다른 물질의 간섭 없이 피크가 분리되어 특이성과 양호한 선형성을 확인하였고, 두 물질 모두 상관계수가(R²)는 0.9997로 매우 높아 농도가 클수록 데이터의 양의 선형관계가 뚜렷하여, 농도 증가에 따라 폴리페놀과 플라보노이드 함량이 크게 증가할 수 있음을 확인하였다. 이것은 우슬의 뿌리가 항산화와 항염 효과가 뛰어난 천연 화합물인 플라보노이드를 다량 포함하고 있음을 시사하며, 20-hydroxyecdysone과 25S-inokosterone의 정량 분석이 가능함을 의미한다. 두 개의 표준품 중에는 20-hydroxyecdysone 50% 에탄올에서 가장 많은 지표성분을 추출할 수 있음을 확인하였다.

본 연구 우슬의 in vitro 실험을 통해 20-hydroxyecdysone와 25S-inokosterone 검량분석결과 또한 우슬의 뿌리가 항산화와 항염 효과가 뛰어난 천연 화합물인 플라보노이드를 다량 포함하고 있음을 확인하고, 우슬의 추출방법에 적합한 표준품 설정 방법을 제시하였다.

Acknowledgements

This research was supported by “Regional Innovation Strategy (RIS)” through the National Research Foundation of Korea (NRF) funded by the Ministry of Education (MOE) (2021RIS-001).

NOTES

Author's contribution

BWY and AJJ designed this study together. LJH and DHK performed experiments, analyzed data, created figures and AJJ and WJK wrote the manuscript. All authors read and confirmed together the definitive version of manuscript.

Author details

Joon Han Lee (Student), School of Industrial Bio-Pharmaceutical Science, Semyung University, Jecheon-si, Chungcheongbuk-do 27136, Korea; Do Hyeong Kim (Ph. D. student), School of Industrial Bio-Pharmaceutical Science, Semyung University, Jecheon-si, Chungcheongbuk-do 27136, Korea; Jin Jung Ahn (Professor), Department of Beauty Care, Semyung University, Jecheon-si, Chungcheongbuk-do 27136, Korea; Byung Wook Yang (Professor), School of Industrial Bio-Pharmaceutical Science, Semyung University, Jecheon-si, Chungcheongbuk-do 27136, Korea.

Figure 1.

Extraction process for Achyranthes fauriei root.

Achyranthes fauriei root (10 g) was extracted three times for 2 hours using 100% ethanol, 50% ethanol, and 200 mL of distilled water. The preparation was concentrated at 70 rpm and 60°C and freeze-dried at -60°C and 12 pa to obtain the Achyranthes fauriei root extract.

Figure 2.

DPPH radical scavenging activity of Achyranthes fauriei root extracts.

A.A, 1 mg/mL of L-ascorbic acid; AFR-100 E, Achyranthes fauriei root extract using 100% ethanol; AFR-50 E, Achyranthes fauriei root extract using 50% ethanol; AFR-D.W., Achyranthes fauriei root extract using distilled water. For the DPPH assay results, the antioxidant effect was highest in the order AFR-100 E>AFR-50 E>AFR-D.W. Values represent the mean±SD of three independent measurements: ^*p<0.05, ^**p<0.01, ^***p<0.001; significantly different from the control by a Students t-test.

Figure 3.

ABTS radical scavenging activity of Achyranthes fauriei root extracts.

A.A, 1 mg/mL of L-ascorbic acid; AFR-100 E, Achyranthes fauriei root extract using 100% ethanol; AFR-50 E, Achyranthes fauriei root extract using 50% ethanol; AFR-D.W., Achyranthes fauriei root extract using distilled water. For the ABTS assay results, the antioxidant effect was highest in the order AFR-50 E > AFR-100 E>AFR-D.W. Values represent the mean±SD of three independent measurements: ^*p<0.05, ^**p<0.01, ^***p<0.001; significantly different from the control by a Students t-test.

Figure 4.

Total polyphenol content of Achyranthes fauriei root extracts.

TAE, tannic acid; AFR-100 E, Achyranthes fauriei root extract using 100% ethanol; AFR-50 E, Achyranthes fauriei root extract using 50% ethanol; AFR-D.W., Achyranthes fauriei root extract using distilled water. Values represent the mean±SD of three independent measurements; ^***p<0.001, significantly different from the control by a Students t-test.

Figure 5.

Tannic acid calibration curve for the determination of TPC.

X: Concentration of tannic acid (µg/mL), Y: Absorbance at 725 nm; y represents the absorbance and x is the concentration of tannic acid. The equation indicates a linear relationship in which the absorbance increases as the concentration of tannic acid increases.

Figure 6.

Total flavonoid content of Achyranthes fauriei root extracts.

Figure 7.

Tannic acid calibration curve for the determination of TFC.

X, concentration of tannic acid (µg/mL); Y, absorbance at 420 nm; y represents the absorbance and x is the concentration of tannic acid. The equation shows a linear relationship in which the absorbance increases as the concentration of tannic acid increases.

Figure 8.

HPLC profiles of mixed standards for Achyranthes fauriei root extracts [AFR-STD 2MIX (100 µg/mL)].

The baseline is stable, indicating that the sample purity is high and the HPLC system is well-maintained.

Figure 9.

HPLC profiles of mixed standards for Achyranthes fauriei root extracts.

Figure 10.

Comparison of ecdysteroid component content of Achyranthes fauriei root.

AFR-100 E, Achyranthes fauriei root extract using 100% ethanol; AFR-50 E, Achyranthes fauriei root extract using 50% ethanol; AFR-D. W., Achyranthes fauriei root extract using distilled water. Both compounds show the lowest concentration in the AFR-D.W. sample, indicating that the distilled water sample contains relatively low amounts of these compounds. 20-hydroxyecdysone shows the highest concentration in the AFR-50 E sample, whereas 25S-inokosterone shows the highest concentration in the AFR-100 E sample.

Figure 11.

Comparison of the calibration curves for 20-hydroxyecdysone and 25S-inokosterone.

The calibration curves for 20-hydroxyecdysone and 25S-inokosterone show a strong linear relationship between concentration and absorbance, with R² values of 0.9999 and 0.9997, respectively. The slope for 20-hydroxyecdysone is lower (9.2564) compared with 25S-inokosterone (9.2903), indicating a marginally higher sensitivity for 20-hydroxyecdysone in the given range. The intercept of 20-hydroxyecdysone is positive (4.2828), whereas that of 25S-inokosterone is negative (-0.392), suggesting different baseline absorbance levels. Both compounds exhibit excellent linearity, which validates the reliability of the calibration models for quantitative analysis.

Table 1.

Extraction yield (%) of Achyranthes fauriei root extracts

Sample	Solvent	Sample: solvent (g:mL)	Extraction time (h)	Amount of solvent (mL)	Yield of the crude extract (% dry weight)
Achyranthes fauriei root	100 % Ethanol	1:20	2 × 3 laps	600	25.00±0.799
Achyranthes fauriei root	50% Ethanol	1:20	2 × 3 laps	600	50.60±1.638
Achyranthes fauriei root	Distilled water	1:20	2 × 3 laps	600	47.92±4.541

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