Salvia microphylla 추출물이 각질형성세포의 피부상처 및 피부장벽 기능에 미치는 영향
요약
목적
Salvia microphylla (SM)은 항돌연변이성, 리파아제 억제 및 살충 효과를 포함한 다양한 생물학적 활성이 연구 보고되었으나 SM에 대한 피부재생 또는 상처치유와 같은 인간 피부 생리 활성에 미치는 연구보고는 미비하다. 본 연구는 피부 각질형성세포에서 SMW의 상처치유 및 피부장벽 개선 효과를 연구하였다.
방법
SMW의 항산화 활성은 DPPH 및 ABTS radical 소거능 방법을 이용하여 측정하였다. 증식은 MTT 분석을 사용하여 측정하였으며, 이동은 스크래치 방법을 사용하여 측정하였다. 증식과 이동 관련 신 호전달체계 확인을 위하여 Weston blot을 통해 확인하였다. Type Ⅰ collagen 합성 및 MMP-1 생성은 ELISA에 의해 확인하였다. 또한, filaggrin, involucrin 및 loricrin의 mRNA 발현은 RT-qPCR로 측정하였다.
결과
SMW의 DPPH 및 ABTS radical 소거 활성은 농도 의존적으로 증가하였다. SMW은 각질형성세포(HaCaTs)의 증식 및 이동을 유도하였으며, 특히 400 μg/mL에서 133.03%의 증식과 213.43%의 이동 유도 활성을 나타내었다. 또한, SMW는 각질형성세포에서 ERK 1/2, p38 MAPK 및 AKT의 인산화에 대한 효과를 나타내었으며, Type I Collagen 합성을 자극하고 MMP-1 생성을 감소시켰다. 피부장벽의 구조와 기능에 중요한 역할을 하는 단백질인 filaggrin 및 involucrin의 mRNA 발현이 유의적으로 증가하는 것을 확인하였다.
결론
이러한 결과들은 SMW가 정상적인 각질형성세포의 재상피화 과정과 상처치유 및 피부장벽 개선에 긍정적인 영향을 미칠 수 있음을 보여줍니다. 향후 SMW는 화장품산업에서 피부재생 및 피부장벽 개선 소재로서 응용가능성을 검증하였다.
핵심용어: 각질형성세포, 재상피화, Salvia microphylla, 피부장벽, 상처치유
Abstract
Purpose
Salvia microphylla (SM) has variety bioactivities including antimutagenic, lipase-inhibitory and insecticidal effects. However, its biological activities on skin remain unclear. In this study, we examined the effect of SM water extract (SMW) of SM on skin wound healing- and skin barrier-linked responses in human keratinocytes (HaCaT cells).
Methods
The antioxidant activities were measured using 2,2′-azino-bis-3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid (ABTS) and 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) radical scavenging assay. Proliferation was confirmed by MTT assay, and migration was measured using a scratch wound healing assay. In order to confirm the proliferation and migration-related signal pathway, it was confirmed by Western blot. Type Ⅰ collagen synthesis and MMP-1 production were confirmed by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). In addition, the expression of filaggrin, involucurin, and loricin were measured by RT-qPCR.
Results
DPPH and ABTS radical scavenging activity of SMW increased a concentration-dependent manner. SMW induced proliferation and migration of HaCaTs, especially at 400 μg/mL(proliferation-inducing activity=133.03%; migration-inducing activity=213.43%). Furthermore, SMW significantly enhanced the phosphorylation of extracellular signal-regulated kinase (ERK) 1/2, p38 MAPK and serine/threonine-specific protein kinase (AKT) in HaCaTs, stimulated Type I collagen synthesis and reduced MMP-1 production. It was confirmed that mRNA expression of filaggrin and involucrin, proteins that play important roles in the structure and function of the skin barrier, was significantly increased.
Conclusion
These results demonstrate that SMW has skin regeneration and wound healing activity and skin barrier improvement in HaCaTs. In the future, SMW was verified for its applicability as a material for skin regeneration and skin barrier improvement material in the cosmetics industry.
Keywords: Keratinocyte, Re-epithelialization, Salvia microphylla, Skin barrier, Wound healing
中文摘要
目的
小叶鼠尾草(SM)具有多种生物活性，包括抗突变、脂肪酶抑制和杀虫作用。然而，其对皮肤的生物活性仍不清楚。在这项研究中，我们研究了SM的水提取物(SMW)对人类角质形成细胞(HaCaT细胞)皮肤伤口愈合和皮肤屏障相关反应的影响。
方法
使用2,2'-联氮基-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)和2,2-二苯基-1-三硝基苯肼(DPPH)自由基清除测定法测量抗氧化活性。通过MTT测定证实增殖，并使用划痕伤口愈合测定测量迁移。为了确认增殖和迁移相关的信号通路，通过Western blot进行证实。通过酶联免疫吸附测定(ELISA)证实Ⅰ型胶原合成和MMP-1产生。此外，还通过RT-qPCR测量了聚丝蛋白、外皮蛋白和兜素的表达。
结果
SMW的DPPH和ABTS自由基清除活性以浓度依赖性方式增加。SMW诱导HaCaTs增殖和迁移，特别是在400 μg/mL时，增殖诱导活性为133.03%；迁移诱导活性为213.43%。此外，SMW显着增强HaCaT中细胞外信号调节激酶(ERK)1/2、p38 MAPK和丝氨酸/苏氨酸特异性蛋白激酶(AKT)的磷酸化，刺激 I 型胶原蛋白合成并减少MMP-1产生。经证实，在皮肤屏障的结构和功能中发挥重要作用的蛋白质丝聚蛋白和外皮蛋白的mRNA表达显着增加。
结论
这些结果表明，SMW在HaCaT中具有皮肤再生和伤口愈合活性以及皮肤屏障改善作用。未来，SMW作为皮肤再生材料和皮肤屏障改善材料在化妆品行业的适用性得到了验证。
关键词: 角质形成细胞, 上皮再生, 小叶鼠尾草, 皮肤屏障, 伤口愈合
Introduction
피부는 먼지, 미생물 등 외부 오염물질로부터 보호하는 피부장벽 역할을 하며, 지속적인 자극으로 손상을 받을 수 있으며, 피부 손상 시 상처치유 과정은 빠르고 효율적으로 회복하는 조직화된 생리적 과정으로 피부 손상 후 염증기(inflammatory phase), 재상피화기(re-epithelialization), 재형성기(remodeling phase)를 거치며 염증 세포(inflammatory cells), 섬유아세포(fibroblasts), 혈소판(platelets), 내피세포(endothelial cells), 각질형성세포(keratinocytes) 등 다양한 세포들에 의해서 치유되는 역동적인 과정이다( Kim & Jeon, 2000; Kim et al., 2020). 피부 표피의 90% 이상을 구성하는 각질형성세포(keratinocyte)는 피부 재상피화(re-epithelialization) 및 상처치유 과정에서 중요한 역할을 한다( Choi et al., 2022; Kim et al., 2016; Garcia et al., 2010). Keratinocyte growth factor, epidermal growth factor (EGF), transforming growth factor-β (TNF-β), interleukin-1 (IL-1) 등의 다양한 사이토카인(cytokine)과 성장인자(growth factor)가 물리화학적 자극에 의한 손상으로 피부 상처 부위에서 분비된다. 이러한 요인들은 각질형성세포를 상처 부위로 이동(migration)시키기 시작하면서 동시에 증식(proliferation)을 유도한다( Santoro & Gaudiano, 2005; Kim et al., 2016; Choi et al., 2022). 각질형성세포의 증식 및 이동은 collagen 및 fibronectin와 같은 extracellular matrix (ECM) 단백질의 합성을 촉진하여 피부 주름과 탄력을 개선하고 피부 재상피화를 매개한다( Kim et al., 2016). 따라서 각질형성세포 활동은 피부재생, 상처치유, 피부장벽 강화 및 노화 억제와 관련이 있습니다( Santoro & Gaudiano, 2005; Kim et al., 2016). 각질형성세포의 이동(migration) 및 증식(proliferation)을 포함한 피부 재상피화는 p38 mitogen-activated protein kinase (MAPK), extracellular signaling-regulated kinase (ERK 1/2), serine/threonine-specific protein kinase (AKT)과 같은 다양한 세포 내 신호전달경로를 활성화하여 재상피화를 촉진하는 다양한 사이토카인(cytokine), 케모카인(chemokine) 및 성장 인자(growth factor)에 의해 유도된다( Kim et al., 2020). Collagen은 피부 진피의 주요 단백질 성분이자 ECM에서 가장 풍부한 단백질이다( Frantz et al., 2010). Type I collagen은 피부 재상피화 과정에서 각질형성세포의 이동에 기여하며( Rousselle et al., 2019), 새로 치유된 상처에도 주요 역할을 한다( Kim et al., 2020; Savvas et al., 1993; Uitto, 1986; O’Toole, 2001). 각질형성세포는 표피세포의 95%를 차지하는 주요 세포로서 기저층(basal layer)에서 증식하여 상층부인 유극층(spinous layer)과 과립층(granular layer)을 거쳐 핵이 없는 각질세포(corneocyte)로 최종 분화된다( Kim et al., 2013). 피부장벽의 구조와 기능에 중요한 역할을 하는 단백질인 인볼루쿠린(involucrin)은 표피의 유극층과 과립층에서, 필라그린(filaggrin)과 로리크린(loricrin)은 표피의 과립층과 각질층에서 각질형성세포(keratinocyte)가 각질세포(corneocyte)로 증식과 분화하는 각화(keratinization)과정과 각질층 형성에 관여하고 물리적 지질층 구조인 피부장벽을 유지하는 역할을 한다( Yu et al., 2015; Koo et al., 2023; Fuchs, 1993; Ishida-Yamamoto et al., 1997; Steinert, 1995; Steven & Steiner, 1994; Furue, 2020; Candi et al., 2005;). FLG은 각질세포 사이의 접착력을 유지하고, LOR와 IVL는 각질세포를 둘러싸고 있는 각질세포 단백질 외막(cornified protein envelope)과 각질세포 지질 외막(cornified lipid envelope)에서 공유결합을 형성하여 피부장벽을 견고하게 형성하는 역할을 담당하고 있다 ( Mu et al., 2014). 또한, FLG는 천연보습인자(natural moisturizing factor, NMF)로 작용한다. 따라서 FLG 기능이 감소하면 각질세포막 형성 감소, 각질세포 사이의 접착력 약화 등으로 및 피부장벽 기능과 수분 손실 방지 기능이 감소되어 피부건조증과 가려움증이 생길 수 있다( Dębińska, 2021).
Salvia microphylla는 멕시코에 서식하는 Salvia 속 식물로 중추신경계, 산부인과 및 부인과 질환 치료와 복통, 설사와 같은 위장 문제를 치료하고 불면증 치료제로 사용되었다( Jenks & Kim, 2013). 또한, 항돌연변이원성( Mathew & Thoppil, 2012), 항리파제 및 항산화( Villa-Ruano et al., 2013), 살충제( Spodoptera frugiperda) 활성에 대하여 연구보고되었다( Romo-Asunción et al., 2016). 그러나 피부재생, 상처치유 및 피부장벽 기능에 대한 Salvia microphylla의 기여 가능성은 아직 명확하게 연구 보고된 바가 없다. 본 연구에서는 Salvia microphylla를 이용하여 피부재생, 상처치유 및 피부장벽 기능에 도움을 주는 기능성 소재를 개발하고자 하였다. SMW의 항산화, 각질형성세포(HaCaT)의 증식(proliferation), 이동(migration) 활성과 피부장벽의 구조와 기능에 관여하는 단백질의 발현을 확인함으로써 피부재생, 상처치유 및 피부장벽 기능을 위한 기능성화장품 소재로 사용 가능성을 제안하고자 한다.
Methods
1. 추출물 제조
본 실험에서 분석을 위해 사용된 Salvia microphylla는 경상남도 거창군에 위치한 플라워쉐프 농장에서 받았다. 열수추출물은 Salvia microphylla 파우더 20 g과 증류수 200 mL을 용매로 100℃에서 2시간 정치하여 추출하였다. 추출물은 여과지(Whatman No.2; GE Healthcare, UK)를 사용하여 2회 여과하고, 감압 하에서 Rotary Evaporator (Eva-5; DAIHAN Scientific, Korea)로 농축하고, 용매를 제거한 후 본 실험에 사용할 때까지 냉동 보관하였다.
2. DPPH radical 소거능 측정
SMW의 항산화 활성을 측정하기 위하여 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH; Alfa Aesar, USA) radical을 일부 변형하여 측정하였다( Blois, 1958). 96-well plate에서 SMW의 농도별(50-600 μg/mL) 시료 120 μL와 0.2 mM DPPH용액 60 μL를 혼합하고 암실에서 15 min 반응 후 microplate reader (Molecular Devices, USA)를 이용하여 흡광도를(517 nm) 측정하였다. 양성 대조군으로 L-ascorbic acid (Sigma-Aldrich, USA)을 사용하였다.
3. ABTS radical 소거능 측정
SMW의 2,2'-azinobis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS) radical 소거 활성 측정은 potassium persulfate와의 반응에 의해 생성되는 ABTs free radical이 항산화제에 의해 소거되어 청색이 탈색되는 것을 이용하여 측정하였다( Re et al., 1999). 96-well plate에서 SMW의 농도별(50-600 μg/mL) 시료 50 μL와 7 mM ABTS (WAKO, Japan) 용액 100 μL를 혼합하고 암실에서 5 min 반응 후 microplate reader를 이용하여 흡광도를(734 nm) 측정하였다. 양성 대조군으로 L-ascorbic acid을 사용하였다.
4. 세포 배양
본 실험에 사용된 HaCaT 세포(Human skin-derived normal keratinocyte cell line)는 호서대학교 에센셜오일소재과학실험실에서 분양받아 사용하였다. HaCaT 세포는 10% fetal bovine serum (FBS; Gibco BRL, USA)와 1% penicillin/streptomycin (Gibco BRL, USA)이 첨가된 Dulbecco’s Modified Essential Medium (DMEM; HyClone, USA)에서 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다.
5. 각질형성세포 증식(Proliferation) 효과 측정
HaCaT 세포 증식(proliferation)은 3-(4,5-Dimethyl-2-thiazoleyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT; Sigma-Aldrich) assay 이용하여 확인하였다. HaCaT (3×103 cells/well) 세포를 96-well plate에 분주하여 37℃, 5% CO2 조건에서 16 h 배양하였다. 그 후 추출물을 농도별로(100-600 g/mL) 처리 후 37℃, 5% CO2 조건에서 48 h 배양하였다. 세포 생존율을 확인하기 위해서 well 당 MTT (5 mg/mL)를 10 L 처리하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 4 h 반응 후 상등액을 제거하였다. 형성된 formazan을 dimethyl sulfoxide (DMSO; Sigma-Aldrich) 150 L로 녹이고 microplate reader를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.
6. 각질형성세포 이동(Migration) 효과 측정
HaCaT 세포 이동(migration)은 scratch wound healing assay을 일부 변형하여 측정하였다( Buranasin et al., 2018). HaCaT (3×10 5 cells/well) 세포를 24-well microtiter plate에 분주 후 37℃, 5% CO 2 조건에서 90% 채워졌을 때까지 배양하였다. 각 well에 200 L pipette yellow tip을 이용하여 스크래치 한 후 추출물을 농도별(100-600 g/mL)로 처리하여 48 h 배양하였다. 도립현미경(ORION, China)을 이용하여 48 h 배양 후 촬영하였다. 촬영된 이미지는 image J software program (National Institute of Health, Bethesda, MD, USA)을 이용하여 이동(migration) 정도를 수치화하였다.
7. Collagen 생합성 측정
HaCaT (1×10 6 cells/well) 세포를 100-mm cell culture plate에 분주 후 37℃, 5% CO 2 조건에서 24 h 배양하였다. 추출물을 농도별(100-600 g/mL)로 처리하여 48 h 배양 후 세포 배양액을 모아 실험에 사용하였다. 이전 연구와 같이 배양액 내 콜라겐 생합성 정도는 procollagen Type I C-peptide (PIP) EIA kit (MK101; TaKaRa, Japan)를 사용하여 흡광도를(540 nm) 측정하였다( Jo & Choi, 2023).
8. MMP-1 활성 측정
HaCaT (1×10 6 cells/well) 세포를 100-mm cell culture plate에 seeding 후, 각 well에 추출물을 농도별(100-600 μg/mL)로 처리하고 MMP-1의 활성을 높이고자 tumor necrosis factor-α (TNF-α; R&D system, USA) 10 ng/mL를 처리하여 37℃, 5% CO 2 조건에서 48 h 배양하였다. 이전 연구와 같이 배양 후 세포 배양액을 수거하여 실험에 사용하였다. 측정은 Human MMP-1 ELISA kit (Thermo Scientific, USA)을 사용하여 측정하였다( Jo & Choi, 2023).
9. RNA extraction and realtime quantitative PCR (RT-qPCR) 분석
HaCaT (5×10 5 cells/well) 세포를 60-mm cell culture plate에 분주 후 37℃, 5% CO 2 조건에서 24 h 배양하였다. HaCaT 세포에 추출물을 100-600 g/mL 처리 후 24 h 동안 배양하였다. 배양액을 제거하고 DEPC PBS로 세포를 세척 후, RiboEx TM (GeneAll Biotechnology Co. Ltd, Korea)을 이용하여 RNA를 추출하였다. Oligo dT primer 1 L, Random primer 0.3 L 와 추출한 RNA (1 g)와 nuclease free water로 20 L를 맞추고 70℃에서 5 min 반응 후, AccuPower ® RT PreMix (Bioneer, Daejeon, Korea)를 사용하여 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA는 GoTaq qPCR Master Mix 2X (Promega, Wi, USA)를 사용하여 95℃에서 3 min, 95℃에서 30 sec, 55℃에서 30 sec, 그리고 72℃에서 30 sec (40 cycles) 증폭조건에 따라 AriaMx Real-time PCR system (Agilent, CA, USA)를 이용하여 RT-qPCR을 진행하였다. 이 연구에서 사용된 프라이머 서열은 다음과 같다( Table 1).
10. Western blot 분석
신호전달 기전인 mitogen-activated protein kinase (MAPKs)에 미치는 영향을 확인하기 위하여 Western blot을 이용하여 진행하였다. HaCaT (1×106 cells/well) 세포를 100-mm cell culture plate에 분주 후 37℃, 5% CO2 조건에서 24 h 배양하였다. HaCaT 세포에 추출물을 농도별로(100-600 μg/mL) 처리하여 10 min 동안 배양하였다. 배양 후 세포를 PBS로 세척하고, 100 μL의 RIPA buffer를 분주하여 세포를 용해시키고, 4℃, 10,000 xg에서 10 min 원심분리하여 상층액을 분리하였다. BCA assay로 단백질을 정량하였다. 12% polyacrylamide SDS gel에서 전기영동 후, polyvinylidene fluoride (PVDF; Sigma-Aldrich, USA) membrane으로 이동시켰다. PVDF membrane을 blocking buffer (3% skim milk; BD Difco, USA)로 2 h blocking하고 Primary antibody인 P-ERK, ERK, P-p38, p38, P-JNK, JNK (Cell Signaling Technology, USA)를 blocking buffer에 희석하여 4℃에서 overnight 하였다. PBS-T (0.05% Tween 20 in PBS)로 세척 후 secondary antibody (CST, USA)를 blocking buffer에 희석하여 실온에서 반응시켰다. PBS-T로 세척하고 West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate (Thermo Scientific, USA)에 반응 후, Chemiluminescent imaging system (Fusion Solo S, VILBER, France)을 이용하여 단백질 발현을 측정하였다.
11. 통계처리
본 실험의 결과는 3회 반복한 값을 mean±SD로 표기하였다. 실험결과의 통계분석은 Graphpad Prism software (version 5.00 for Windows, USA) 프로그램을 사용한 one way ANOVA의 Tukey’s test 방법을 사용하여 그 결과를 *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 수준에서 유의성을 검증하였다.
Results and Discussion
1. Salvia microphylla 추출물의 DPPH 및 ABTS radical 소거능 평가
SMW의 DPPH radical 소거능을 측정한 결과는 Figure 1에 나타내었다. 보라색의 DPPH가 항산화 물질에 의해 환원되면서 노란색으로 탈색되는 원리를 이용하여 산화 방지제 활성을 측정하는 방법으로 비교적 간단하여 항산화 활성을 탐색할 때 유용하다( Huang et al., 2005). ABTS radical 소거능은 단기간에 측정이 가능한 항산화 측정방법으로 항산화제가 potassium persulfate과 반응하여 생성된 ABTs radical을 제거한다는 점을 이용하여 극성물질과 비극성물질 모두 측정할 수 있다( Um & Ryu, 2022). SMW의 DPPH 및 ABTS radical 소거능은 50-600 μg/mL의 농도에서 농도 의존적인 증가를 확인하였다. SMW의 최대 DPPH 및 ABTS radical 소거능은 양성대조군 L-ascorbic acid과 유사하였다. 이러한 결과는 SMW이 화장품 및 식품에서 항산화 소재로서 도움을 줄 것으로 사료된다.
2. Salvia microphylla 추출물이 각질형성세포의 증식(proliferation) 및 이동(migration)에 미치는 효과
본 연구에서는 각질형성세포의 증식(proliferation)과 물리적인 스크래치에 대한 각질형성세포의 이동(migration)을 측정함으로써 SMW의 피부 상처치유 및 재생 촉진 효과를 확인하고자 하였다. SMW는 농도 의존적으로(100-400 μg/mL) HaCaT 세포의 증식(proliferation)과 이동(migration)을 유도하는 것이 관찰되었으며, 증식의 유도 활성은 400 μg/mL 농도에서 133.03±0.74%로 최대 증식(proliferation)을 나타내었다( Figure 2). 이동의 유도 활성은 400 μg/mL 농도에서 213.43±28.68%로 최대 이동(migration)을 나타내었다( Figure 3). 따라서, SMW이 각질형성세포의 증식과 이동을 자극함으로써 피부재생과 상처치유 과정에 기여할 수 있을 것으로 판단된다.
3. Salvia microphylla 추출물의 Type Ⅰ collagen 생합성능 평가
피부 조직에서 collagen은 피부 상처치유의 증식 및 리모델링 단계에서 중요한 역할을 하며( Li et al., 2007), collagen은 진피의 주요 단백질 성분으로 ECM의 주요 구성요소로서 상처 치유 과정에서 핵심적인 역할을 수행한다( Frantz et al., 2010; Kim et al., 2022; Noh et al., 2024). 각질형성세포의 증식과 이주 활성은 피부조직 리모델링 과정 중 type I, IV collagen 등의 피부 구성 단백질 합성에 관여하며, 피부 탄력 및 피부장벽 개선 등을 유도한다고 보고되었다( Kim et al., 2016; O'Toole et al., 2001; Schultz & Wysock 2009). 특히, Type Ⅰ collagen은 각질세포가 상처 부위로 이동하는 과정에서 유도되어 상처치유에 필수적인 역할을 한다( Cioce et al., 2024; Martin & Nunan, 2015; O'Toole et al., 2001). 따라서 본 연구에서는 SMW가 각질형성세포의 Type Ⅰ collagen 합성에 미치는 영향을 확인하고자 하였다. SMW은 농도 의존적으로(100-400 μg/mL) Type Ⅰ collagen 생합성을 증가하였으며, 특히 400 μg/mL 농도에서 119.90±1.02% 증가하였다( Figure 4). 이와 같이 각질형성세포에서 Type Ⅰ collagen 합성을 유도하는 SMW이 상처치유 및 피부재생에 기여할 수 있음을 시사한다.
4. Salvia microphylla 추출물의 MMP-1 생성 저해능 평가
Collagen 분해는 결합 조직의 탄력성과 주름 형성에 직접적인 영향을 미치며, 체내에서 생성되는 수십 개의 MMP 중 MMP-1은 콜라겐에 특이적으로 작용하여 MMP-1의 활성을 억제하고 콜라겐 분해를 감소시키며 피부 조직의 탄력성을 유지하며 주름 형성을 예방하는 단백질분해효소이다( Nagase & Woessner, 1999). 본 연구에서는 Human MMP-1 ELISA kit를 이용하여 SMW의 MMP-1 억제 활성을 확인하고자 하였다. SMW은 농도 의존적으로(100-400 μg/mL) MMP-1 생성을 저해하였으며, 특히 400 μg/mL 농도에서 53.48±0.10%로 MMP-1 생성 감소를 나타내었다( Figure 5). 이러한 결과는 SMW이 각질형성세포에서 type Ⅰ collagen 생합성 촉진과 MMP-1 생성 억제를 유도하여 피부재생 및 상처치유 과정에 기여할 수 있을 것으로 판단된다.
5. Salvia microphylla 추출물의 각질형성세포 내 신호전달에 미치는 영향
각질형성세포의 증식과 이동은 정상적인 각질형성층의 유지뿐만 아니라, 피부조직의 재형성과 상처치유 등의 과정에서 매우 중요한 요소이며, 다양한 신호전달 경로를 통해 매개된다( Kim et al., 2016; Li et al., 2021). ERK1/2는 인산화가 증가함에 따라 각질세포의 이동성과 증식을 촉진하며, p38 MAPK는 각질형성세포의 이동과 증식에 관여하여 피부 세포 활동에 중요한 역할을 한다( Kim et al., 2023; Osaki & Gama, 2013). AKT는 세포의 생존, 증식, 이동 등에 관여하며, 표피 세포의 유지 및 피부 구조의 안정성을 보존하는 데 중요한 역할을 한다 ( Ruttanapattanakul et al., 2021). 본 연구에서는 SMW가 신호전달에 미치는 영향을 확인하기 위하여 Western blot을 이용하여 확인하였다. SMW은 ERK 1/2, p38 MAPK 및 AKT의 인산화를 농도 의존적으로(100-400 μg/mL) 증가하는 것을 확인하였다( Figure 6). ERK 1/2의 인산화는 400 μg/mL에서 음성대조군에 비해 258.13±10.53%의 인산화 증가( Figure 6B), p38 MAPK의 인산화는 400 μg/mL에서 음성대조군에 비해 186.68±16.60%의 인산화 증가( Figure 6C) 및 AKT의 인산화는 400 μg/mL에서 음성대조군에 비해 278.17±5.91%의 인산화 증가( Figure 6D)를 확인하였다. 본 연구를 통해 SMW가 각질형성세포의 ERK 1/2, p38 MAPK 및 AKT의 인산화를 조절하여 세포의 증식과 이동에 기여하는 것으로 판단된다.
5. Salvia microphylla 추출물의 각질형성세포 내 Filaggrin, Involucrin, Loricrin의 mRNA 발현에 미치는 영향
피부장벽의 구조와 기능에 중요한 역할을 하는 단백질인 FLG, IVL 및 LOR의 발현 조절 효과는 피부장벽기능 개선 소재의 효능 평가 방법으로 이용되고 있다( Koo et al., 2023). 본 연구에서는 SMW 의 피부장벽 구성성분 단백질 발현에 미치는 영향을 확인하기 위하여 RT-qPCR을 사용하여 FLG, IVL 및 LOR의 mRNA 발현을 확인하였다. Calcium은 각질형성세포 분화의 촉진에 관여하는 생체 인자로서 피부장벽기능의 강화에 관련하는 인자들의 발현 관찰에서 양성 대조군으로 사용하였다( Yu et al., 2015). SMW 400 μg/mL 농도에서 FLG의 mRNA 발현은 511.30%, INV의 mRNA 발현은 183.39%로 대조군에 비해 유의한 증가를 나타내었으며, LOR의 mRNA 발현은 185.15%로 대조군에 비해 증가는 하였으나 유의한 증가 효과를 나타내지 않았다( Figure 7). 본 연구 결과는 SMW가 FLG과 IVL를 선택적으로 조절하여 피부장벽 강화에 기여할 수 있을 것으로 판단된다.
Conclusion
피부는 외부 병원체 및 유해물질로부터 신체를 보호하는 중요한 장벽으로 작용을 하며, 피부장벽 무결성이 손상되면 피부 상처치유 과정이 활성화되어 손상을 복구하고 피부장벽 기능을 회복한다( Evans et al., 2013). 본 연구에서는 SMW이 피부 각질형성세포의 증식과 이동 유도활성을 확인하고 상처치유, 피부재생 및 피부장벽 개선 가능성을 제시하였다. 각질형성세포의 증식(proliferation)과 물리적인 스크래치에 대한 각질형성세포의 이동(migration)을 측정함으로써 SMW이 HaCaTs의 증식과 이동을 자극하고 피부 상처치유 및 재생 촉진 효과를 확인하고자 하였다. Salvia microphylla 열수추출물은 100-400 μg/mL 농도범위에서 HaCaTs의 증식(proliferation) 이동(migration)을 농도의존적으로 유도하였으며, ERK1/2, p38 MAPK 및 AKT 신호전달경로를 통해 매개됨이 관찰되었다. MMPs는 광노화, 상처치유, 세포 재형성, 염증, 암 등의 병리학적 과정에서 중요한 역할을 하며, MMP-1은 대표적인 collagenase로서 type I collagen과 type III collagen을 분해한다고 연구보고 되었다( Pittayapruek et al., 2016). SMW은 각질형성세포 내에서 MMP-1의 발현 억제 효과와 type I procollagen의 생합성 유도를 확인하였다. 각질형성세포에서 피부장벽의 구조와 기능에 중요한 역할을 하는 단백질인 FLG와 IVL의 mRNA 발현은 유의한 증가를 확인하였다. 이러한 결과는 Salvia microphylla 열수추출물이 이동 및 증식 활동, 콜라겐 합성 및 피부장벽 단백질을 자극하여 피부 상처치유 및 피장장벽 복구를 촉진할 수 있음을 시사한다. 따라서 Salvia microphylla 열수추출물은 피부 상처 및 장벽 복구 기능을 향상시키는 기능성 소재를 개발하는 데 유용할 것으로 판단된다.
Acknowledgements
이 성과는 정부(과학기술정보통신부)의 재원으로 한국연구재단의 지원을 받아 수행된 연구임(No. 2021R1G1A1094165).
Figure 1.
DPPH and ABTS radical-scavenging activity of a Salvia microphylla extract.
(A) A DPPH radical-scavenging assay was performed to test the antioxidant effect of SMW at different concentrations (50–600 μg/mL). Activities were determined by measuring the absorbance at 517 nm. (B) An ABTS radical-scavenging assay was performed to test the antioxidant effect of SMW at different concentrations (50–600 μg/mL). Activities were determined by measuring the absorbance at 734 nm, and L-ascorbic acid was used as a positive control in each analysis. The values are expressed as the mean±SD of three independent experiments. ***p<0.001 compared with the untreated control. Con, untreated control; SMW, Salvia microphylla water extract.
Figure 2.
Effects of Salvia microphylla extract on the proliferation of HaCaT cells.
HaCaTs were incubated with SMW at different concentrations (100–600 μg/mL) for 48 h, and cell proliferation was determined by performing the MTT assay. Recombinant human epidermal growth factor (rhEGF; 50 ng/mL) was used as a positive control. The responses of the untreated control (con) in each test are expressed as 100 %. Each value expresses the mean±SD of three independent experiments. ***p<0.001 compared with the untreated control. Con, untreated control; SMW, Salvia microphylla water extract.
Figure 3.
Effect of Salvia microphylla extract on the migration of HaCaT cells.
HaCaTs were exposed to SMW at different concentrations (100–600 μg/mL) for 48 h, and scratch wounds were made with a pipette tip. Wound areas were observed by inverted microscopy at×4 magnification. Statistical graphs were made. Panel A) The Image J program was used to measure the wound areas. The percentage at 48 h vs 0 h for the untreated control (con) was taken as 100%. Each value is expressed as the mean±SD (n=5). ***p<0.001 compared with the untreated control. Con, untreated control; SMW, Salvia microphylla water extract.
Figure 4.
Effect of Salvia microphylla extracts on collagen synthesis in HaCaT cells.
HaCaT cells were treated without or with SMW (100–600 μg/mL) for 48 h. The condition medium was subjected to a collagen synthesis analysis using a procollagen type I C-peptide (PIP) EIA kit. The levels in the untreated control (Con) were designated as 100 %. Each value expresses the mean±SD of three independent experiments. ***p<0.001 compared with the untreated control. Con, untreated control; SMW, Salvia microphylla water extract.
Figure 5.
Effect of Salvia microphylla extracts on MMP-1 expression in HaCaT cells.
HaCaT cells were treated without or with SMW (100–600 μg/mL) in the presence or absence of TNF-α (10 ng/mL) for 48 h. The condition medium was subjected to MMP-1 expression analysis using ELISA. Each value expresses the mean±SD of three independent experiments. #p<0.05 compared with the untreated control. **p<0.01, ***p<0.001 compared with TNF-α. TNF-α, tumor necrosis factor-α; SMW: Salvia microphylla water extract.
Figure 6.
Activations of protein kinases in HaCaTs in response to a Salvia microphylla extract.
(A) HaCaTs were treated with recombinant human epidermal growth factor (EGF; 5 ng/mL) or SMW (100–600 μg/mL) for 10 min. The cell lysates were immunoblotted with the indicated antibodies (n=3 for each protein). (B-D) The statistical graphs were obtained from panel A. Response levels in untreated controls (Con) were designated as 100%. Each value expresses the mean±SD of three independent experiments. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 compared with the untreated control. Con, untreated controls; rhEGF, recombinant human epidermal growth factor; P-ERK1/2, phosphorylated ERK1/2; P-p38 MAPK, Phosphorylated p38 MAPK; p-AKT, phosphorylated AKT; SMW, Salvia microphylla water extract.
Figure 7.
Effect of Salvia microphylla extracts on the mRNA expressions of filaggrin, involucrin, and loricrin.
HaCaT cells were treated with SMA (100–600 μg/mL) for 24 h. The positive control was 1.5 mM CaCl2 to induce differentiation. The mRNA expression levels of (A); filaggrin (FLG), (B); involucrin (IVL), and (C); loricrin (LOR) were determined by qRT-PCR. Each value expresses the mean±SD of three independent experiments. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 compared with the untreated control. Con, untreated control; SMW, Salvia microphylla water extract.
Table 1.
Sequence of target gene-specific primers used in the RT-PCR
|
Target gene |
Primer sequence |
|
Filaggrin (FLG) |
Forward |
5′-CCGGCTTGGCCGTAATGTGT-3′ |
|
Reverse |
5′-AGGAAGATCCAAGAGCCCA-3′ |
|
Involucrin (IVL) |
Forward |
5′-GGTCCCATCAAAGCAAGAGG-3′ |
|
Reverse |
5′-TGCTCACATTCTTGCTCAGG-3′ |
|
Loricrin (LOR) |
Forward |
5′-CACTGGGGTTGGGAGGTAGT-3′ |
|
Reverse |
5′-GCTCTCATGATGCTACCCGA-3′ |
|
GAPDH
|
Forward |
5′-CAAGAAGGTGGTGAAGCAGG-3′ |
|
Reverse |
5′-GTCAAAGGTGGAGGAGTGGG-3′ |
References
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