Effects of <i>Smilax china</i> Ethanol Extract on Anti-inflammation and Skin Barrier Function

Jo, Hyeon Mi; Choi, In Ho; Hyeon Mi Jo; In Ho Choi

doi:10.20402/ajbc.2024.0086

Asian J Beauty Cosmetol > Volume 22(4); 2024 > Article

Smilax china 에탄올 추출물의 항염 및 피부 장벽 기능에 대한 효과

Research Article

Asian J Beauty Cosmetol 2024; 22(4): 657-669.

Published online: December 16, 2024

DOI: https://doi.org/10.20402/ajbc.2024.0086

Smilax china 에탄올 추출물의 항염 및 피부 장벽 기능에 대한 효과

조현미¹, 최인호^1,^2,^*

¹경상국립대학교 바이오신소재과학과, 경상남도 진주시, 한국

²경상국립대학교 항노화신소재과학과, 경상남도 진주시, 한국

Effects of Smilax china Ethanol Extract on Anti-inflammation and Skin Barrier Function

Hyeon Mi Jo¹, In Ho Choi^1,^2,^*

¹Department of Biomaterials Science, Gyeongsang National University, Jinju-si, Gyeongsangnam-do, Korea

²Department of Plant and Biomaterials Science, Gyeongsang National University, Jinju-si, Gyeongsangnam-do, Korea

菝葜乙醇提取物的抗炎和皮肤屏障功能的作用

趙賢美¹, 崔仁鎬^1,^2,^*

¹庆尚国立大学生物新素材科学科，庆尚南道晋州市，韩国

²庆尚国立大学抗衰老新素材科学科，庆尚南道晋州市，韩国

^*Corresponding author: In Ho Choi, Department of Plant and Biomaterials Science, Gyeongsang National University, 33, Dongjin-ro, Jinju-si, Gyeongsangnam-do 52725, Gyeongsangnam-do, 52725, Korea Tel.: +82 55 772 3228 Fax: +82 55 772 3771 Email: inhochoi@gnu.ac.kr

Received October 28, 2024 Revised November 19, 2024 Accepted December 2, 2024

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요약

목적

본 연구는 Smilax china 에탄올 추출물(SCR)이 항염증 및 피부 장벽 기능 개선에 미치는 영향을 조사하였으며, SCR이 염증성 피부질환을 완화할 수 있는 천연 소재로서의 가능성을 확인하였다.

방법

RAW 264.7 cells과 HaCaT cells의 세포 생존율은 MTT 분석을 통해 측정하였다. 항염증 활성은 NO 생성 억제, iNOS와 COX-2의 단백질 발현, 그리고 사이토카인의 mRNA 발현 수준을 확인하여 검증하였다. Type Ⅰ collagen 합성은 ELISA를 통해 확인하였으며, MMP-1 단백질 발현은 Western blot으로 측정하였고, 피부 장벽 기능 관련 mRNA 발현은 RT-PCR을 이용하여 측정하였다.

결과

SCR은 농도 의존적으로 NO 생성 억제, 전염증성 사이토카인(TNF-α, IL-1β, IL-6), 그리고 iNOS와 COX-2의 발현을 현저히 감소시켰다. 또한, SCR은 collagenase를 억제하고 HaCaT cells에서 Type Ⅰ collagen 합성을 촉진하였다. SCR은 MMP-1 생성을 감소시키고 필라그린(filaggrin), 인볼루크린(involucrin), 로리크린(loricrin) 등 피부 장벽 기능에 중요한 mRNA 발현을 증가시켰다.

결론

이러한 결과는 SCR이 피부 장벽 기능 강화 및 항염 효과를 통해 염증성 피부질환의 증상 완화에 기여할 수 있음을 시사한다. 따라서 SCR은 화장품 산업에서 아토피 피부염 완화에 도움이 되는 기능성 소재로 활용 가능성이 높다고 판단된다.

핵심용어: 항염증, 아토피 피부염, 각질형성세포, 피부 장벽, Smilax china

Abstract

Purpose

This study investigated the effect of Smilax china ethanol extract (SCR) on improving anti-inflammatory and skin barrier function to confirm the potential of SCR as a natural material that can alleviate inflammatory skin diseases.

Methods

The viability of macrophages (RAW 264.7 cells) and keratinocytes (HaCaT cells) following SCR treatment was assessed using the MTT assay. Anti-inflammatory activity was verified by confirming the inhibition of nitric oxide (NO) production, the expression of inducible nitric oxide synthase (iNOS) and cyclooxygenase-2 (COX-2) proteins, and the expression of cytokine mRNA. Collagen synthesis was confirmed by enzyme immunoassay. The expression of matrix metalloproteinase-1 (MMP-1) protein was determined using Western blot. The effect of SCR on skin barrier function was assessed using reverse-transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) assay targeting filaggrin, involucrin, and loricrin mRNA.

Results

SCR significantly reduced NO production, the levels of proinflammatory cytokines (tumor necrosis factor-α, interleukin [IL]-1β, and IL-6), and iNOS and COX-2 expression in a concentration-dependent manner. SCR also inhibited collagenase and promoted type Ⅰ collagen synthesis in HaCaT cells. Furthermore, SCR decreased MMP-1 production and enhanced the mRNA expression levels of filaggrin, involucrin, and loricrin, which are essential for skin barrier function.

Conclusion

Our findings suggest that SCR contributes to the symptomatic relief of inflammatory skin diseases by enhancing skin barrier function and exerting an anti-inflammatory effect. Therefore, SCR may be a potential functional material that can be used by the cosmetic industry to help alleviate atopic dermatitis.

Keywords: Anti-inflammation, Atopic dermatitis, Keratinocyte, Skin barrier, Smilax china

中文摘要

目的

本研究调查了菝葜乙醇提取物(SCR)在改善抗炎和皮肤屏障功能方面的作用，以证实SCR作为缓解炎症性皮肤病的天然材料的潜力。

方法

使用MTT测定评估SCR处理后巨噬细胞(RAW 264.7 细胞)和角质形成细胞(HaCaT 细胞)的活力。通过确认一氧化氮(NO)产生的抑制、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和环氧合酶-2 (COX-2)蛋白的表达以及细胞因子mRNA的表达来验证抗炎活性。通过酶免疫测定法证实胶原合成。使用蛋白质印迹法测定基质金属蛋白酶-1(MMP-1)蛋白的表达。使用针对聚丝蛋白、外皮蛋白和兜甲蛋白mRNA的逆转录聚合酶链反应(RT-PCR) 测定评估SCR对皮肤屏障功能的影响。

结果

SCR以浓度依赖性方式显着降低NO产生、促炎细胞因子(TNF-α, IL-1β, IL-6)水平以及iNOS和COX-2表达。SCR还抑制胶原酶并促进HaCaT细胞中Ⅰ型胶原的合成。此外，SCR降低了MMP-1的产生，并增强了丝聚蛋白、外皮蛋白和兜甲蛋白的mRNA表达水平，这些对于皮肤屏障功能至关重要。

结论

我们的研究结果表明，SCR通过增强皮肤屏障功能并发挥抗炎作用，有助于缓解炎症性皮肤病的症状。因此，SCR可能是一种潜在的功能材料，可以被化妆品行业用来帮助缓解特应性皮炎。

关键词: 抗炎, 特应性皮炎, 角质形成细胞, 皮肤屏障, 菝葜

Introduction

아토피 피부염(atopic dermatitis)이란 가려움증, 건조, 소양증, 홍반성 습진 등의 증상을 동반하는 만성 염증성 피부질환이다(Hong et al., 2019; Kim et al., 2013). 아토피 피부염은 유전학적인 원인, 환경적 원인, 면역 체계 이상, 피부장벽의 이상 등이 주요 원인으로 꼽히고 있다(Koo et al., 2023; Kim et al., 2013). 아토피 피부염은 재발 가능성이 높고 다른 질병과 함께 발병하기 쉬운 질환이기 때문에 지속적인 관리와 재발 방지가 필요하며, 이를 위해 피부 장벽의 기능을 강화하고 염증반응을 억제하는 것이 중요하다(Koo et al., 2023).

피부는 인체의 가장 외부에 존재하는 기관으로 체내 수분을 유지하고 병원균과 외부 유해 물질의 침입을 차단 및 방어하는 피부 장벽 기능을 수행한다(Sandilands et al., 2009; Kim et al., 2013). 특히, 각질형성세포(keratinocyte)는 표피의 대부분을 차지하는 세포로서 기저층(basal layer)에서 증식하여 유극층(spinous layer), 과립층(granular layer)을 거쳐 핵이 없고 납작한 각질세포(corneocyte)로 최종 분화(differentiation)하며, 동시에 표피의 과립층과 유극층 상부에서 involucrin (IVL), 표피의 과립층과 각질층에서 loricrin (LOR), filaggrin (FLG) 등의 분화를 촉진하는 단백질들이 발현한다(Oh & Jang, 2015; So et al., 2019; Yu et al., 2015). FLG, IVL, LOR은 피부 장벽과 투과 기능을 유지하는 데 필수적인 단백질로(Yu et al., 2015), 각질 내 단단한 각질세포막(cornified cell envelope)을 형성하여 외부 환경으로부터 인체를 보호하고, 수분 유지 및 피부 장벽 기능을 강화하는 역할을 한다(Bak et al., 2023; Jeong et al., 2012; Hänel et al., 2013). 그러나 피부 장벽이 붕괴되거나 외부 물질이 침투하게 되면 체내 면역세포를 자극해 염증 반응이 시작되고, 이러한 염증이 만성적으로 지속되면 이후 염증성 피부 질환의 원인이 된다(Sandilands et al., 2009; Kwon et al., 2023).

대식세포는 염증의 시작부터 발달 및 해소에 필수적인 역할을 하는 면역세포 중 하나이며, 외부 병원체에 대한 신속한 방어와 T 세포 및 B 세포 같은 후천성 면역세포와 면역반응을 조절하여 인체의 면역시스템에서 중요한 역할을 한다(Orecchioni et al., 2019; Yang et al., 2014). 염증 반응이 시작되면 대식 세포가 활성화되어 세포 내부로 신호를 전달하고 nitric oxide (NO), inducible nitric oxide synthase (iNOS), cyclooxygenase-2 (COX-2)와 염증성 사이토카인과 같은 다양한 염증 매개체를 생성하여 만성 염증을 일으킨다(Kim et al., 2012a; Jeong et al., 2012). 염증은 조직의 손상 또는 외부로부터의 감염과 같은 자극에 의한 생체 방어 시스템이며, 생체를 보호하고 회복하기 위한 다양한 생리학적, 병리학적 기작이다(Kim et al., 2012a; Shin et al., 2023). 그러나 염증 반응이 만성적으로 발생하게 되어 염증 매개 물질이 조절되지 않으면 암, 동맥경화, 당뇨 등의 질병뿐만 아니라(Kim et al., 2012a; Kim et al., 2012b), 피부 장벽이 붕괴되어 아토피 피부염, 건선 등 염증성 피부질환을 촉진한다 (Kwon et al., 2023). 염증성 피부 질환 치료를 위해 장기간 사용되었던 약제인 스테로이드 및 항히스타민제제는 장기 복용으로 인한 체중 증가, 당뇨, 고지혈증, 피부 부작용 등으로 인해 안전하고 효과적인 천연물 유래 치료제 연구가 필요하다(Bak et al., 2023; Lee et al., 2023). 아토피 피부염을 개선하기 위해 피부 장벽의 기능을 강화하고 염증반응을 억제할 수 있는 새로운 소재를 탐색하는 것이 중요하다고 판단되어 피부장벽 강화와 항염증 효과를 가진 천연 소재를 발굴하고자 한다.

토복령(Smilax china)은 백합과(Lilaceae) 덩굴성 관목인 청미래 덩굴의 뿌리이며, 한국, 중국, 일본과 인도차이나 등에 널리 분포하는 식물이다(Lee et al., 2016c). 토복령의 주요 약리학적 효능으로는 항여드름(Park & Kwon, 2017), 항건선(Vijayalakshmi et al., 2012), 미백(Lee et al., 2016c), 골반의 항염 효과 등이 보고되었다(Song et al., 2017). 그러나 토복령 에탄올 추출물의 항염증, 피부장벽 기능 강화를 통한 아토피 피부염에 관한 연구는 아직 미비하다. 따라서 이 연구는 SCR이 LPS로 자극된 대식세포의 염증을 억제하고, 각질형성세포에서 피부장벽 기능을 강화하여 염증성 피부질환을 개선할 수 있는 소재로서의 잠재력을 확인하였다.

Materials and Methods

1. 추출물 준비

본 실험에서 분석을 위해 사용된 Smilax china 뿌리는 대구 약령 시장에서 구매하여 사용하였다. 분쇄된 Smilax china 뿌리(SCR) 100 g을 50% 에탄올 2000 mL를 용매로 상온에서 7일간 정치하여 추출하였으며, 추출물은 여과지(Whatman No.2; GE Healthcare, UK)를 사용하여 2회 여과하고, Rotary Evaporator (Eva-05; DAIHAN Scientific, Korea)로 감압 농축한 후 본 실험에 사용할 때까지 -35℃ 보관하였다.

2. Collagenase 효소 억제능 측정

0.1M tris-HCl buffer에 4 mM calcium chloride를 첨가하여 기질과 효소의 용해에 사용하였다. 0.2 mg/mL collagnease (Sigma, USA) 150 μL와 SCR 농도별(25-100 μg/mL) 100 μL를 첨가하여 5 min간 반응시켰다. 반응 후 0.5 mg/mL 4-phenylazobenzyloxycarbonyl-Pro-Leu-Gly-Pro-D-Arg (Sigma, USA) 250 μL를 첨가하여 15 min 반응시켰다. 반응 정지액인 5% citric acid 0.5 mL를 넣고 10 min 동안 정치시키고 ethyl acetate 2 mL를 첨가하여 320 nm에서 흡광도를 측정하였다.

3. 세포 배양

본 실험에 사용된 RAW 264.7 cells은 American Type Culture Collection (ATTC; USA)에서 분양 받아 사용하였다. RAW 264.7 cells은 10% fetal bovine serum (FBS; Gibco BRL, USA)와 1% penicillin/streptomycin (Gibco BRL, USA)을 넣은 Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM; GenDepot, USA)에서 배양하였다. HaCaT cells은 호서대학교 에센셜오일소재과학연구실에서 분양 받아 사용하였다. HaCaT cells은 10% FBS와 1% penicillin/streptomycin을 넣은 DMEM (Hyclone, USA)에서 배양하였다. 세포는 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 배양하였다.

4. 세포 생존율 측정

SCR의 RAW 264.7 cells과 HaCaT cells에 대한 생존율은 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay을 이용하였다. RAW 264.7 cells와 HaCaT cells는 96-well plate에 3×10³ cells/well 농도로 분주하여 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 24 h 동안 배양하였다. 배양 후 SCR을 25-400 μg/mL로 희석하여 처리하고 24 h 배양하였다. 그 후 MTT (Sigma, USA) 5 mg/mL 10 μL를 각 well에 넣은 후 인큐베이터에서 4 h 배양하였다. 배양 후 상등액을 제거하고 생성된 formazan 결정을 DMSO 150 μL로 용해한 후 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.

5. Type Ⅰ collagen 생합성 측정

HaCaT cells를 100-mm cell culture plate에 1×10⁶ cells/well로 분주 후 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 24 h 동안 배양하였다. SCR을 농도별(25-100 g/mL)로 처리하고 24 h 배양 후 세포의 배양액을 모아 실험에 사용하였다. 배양액 내 콜라겐 생합성 정도는 procollagen Type I C-peptide (PIP) EIA kit (TaKaRa, Japan)를 사용하였으며, 제조사의 protocol을 참고하여 측정하였다.

6. Nitric oxide (NO) 생성능 측정

RAW 264.7 cells를 24-well plate에 2.5×10⁵ cells/well의 농도로 분주하여 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 24 h 동안 배양하였다. 반응 후 SCR을 농도별(25-200 μg/mL)로 처리하여 1 h 배양 후 lipopolysaccharide (LPS; Sigma, USA) 1 μg/mL 농도로 처리하여 24 h 배양하였다. 세포 배양액 50 μL와 Griess reasent (promega, USA)을 첨가하여 20 min 반응 후 520 nm에서 흡광도를 측정하였다. NO 생성능은 sodium nitrite (NaNO₂)로 표준 곡선을 작성하여 NO의 생성능을 측정하였다.

7. Western blot

RAW 264.7 cells 또는 HaCaT cells을 100-mm cell culture dish에 1×10⁶ cells/well로 분주 하여 24 h 동안 배양 후 SCR을 농도별로 처리하여 1 h 배양하였다. 그 후 RAW 264.7 cells은 LPS를 1 μg/mL 농도로 처리하고, HaCaT cells은 TNF-α (R&D system, USA) 10 ng/mL 농도로 처리하여 24 h 동안 배양하였다. 배양 후 세포를 PBS로 washing하고, RIPA buffer 100 μL를 분주하여 세포를 용해시키고, 4℃ 10,000 x g에서 10 min 원심 분리하여 상등액을 분리하였다. BCA assay을 이용하여 단백질을 정량 하였다. 12% SDS PAGE gel을 사용하여 전기영동을 실시하였으며, 전기영동으로 분리한 단백질은 PVDF membrane에 transfer하였다. 단백질이 이동된 membrane은 3% skim milk 또는 3% bovine serum albumin (BSA) solution으로 blocking하였다. 이 후, 1차 항체인 iNOS (1:1000; Cell Signaling Technology, USA), COX-2 (1:1000, Santa Cruz Biotechnology, USA), MMP-1 (1:500, Cell Signaling Technology, USA)를 4℃에서 overnight 하였다. PBS-T (phosphate-buffered saline in 0.05% Tween-20) 용액으로 washing한 후 2차 항체를 분주한 후 상온에서 1 h 배양하고 PBS-T로 washing하였다. ECL 용액으로 반응시킨 뒤 화학 발광 이미징 시스템(Fusion solo s, VILBER, France)을 통해 단백질을 확인하였다.

8. Total RNA 분리 및 cDNA 합성

RAW 264.7 cells 또는 HaCaT cells을 60-mm cell culture dish에 5×10⁵ cells/well로 분주하여 24 h 배양하였다. RAW 264.7 cells은 SCR을 농도별로 처리하여 1 h 배양 후 LPS 1 μg/mL를 처리하여 6 h 배양하였고, HaCaT cells은 SCR을 농도별로 처리한 뒤 24 h 동안 배양하였다. 배양액을 제거하고 diethylpyrocarbonate (DEPC) PBS로 세포를 세척한 뒤 RiboEx^TM (GeneAll Biotechnology Co. Ltd, Korea) 500 μL로 세포를 lysis 하였다. 세포 용해물에 100 μL의 chloroform을 첨가한 후 4℃에서 12,000 x g 15 min 원심분리하였다. 원심분리 한 후 상층액을 취하여 isopropanol 500 μL를 혼합하여 10 min 동안 반응하였다. 이후 4℃ 12,000 x g 10 min 원심 분리하여 상층액을 제거하고 pellet만 남겨두었다. Pellet을 DEPC water로 희석한 75% 에탄올 1 mL을 첨가하여 세척하였다. 세척액을 제거해준 후 DEPC water를 분주하여 pellet을 희석하였다. Total RNA 농도는 SPECTROstar NANO (BMG Labtech, Germany)를 사용하여 측정하였다. RNA 1 μg, Oligo dT 1 μL와 random primer 0.3 μL을 72℃ 5 min 동안 반응시킨 뒤 AccuPower^® RT PreMix (Bioneer, Korea)로 cDNA를 합성하였다.

9. Reverse transcription-PCR (RT-PCR)

합성된 cDNA는 RT-PCR 증폭을 위한 template로 사용되었으며, Taq DNA Polymerase (Bioneer, Korea)와 primer sequence를 섞어 RT-PCR을 진행하였다. 실험에 사용된 primer sequence는 Table 1에 나열하였다. PCR 조건은 95℃에서 3 min pre-denaturation 후, 95℃에서 30 s, 55℃에서 30 s, 72℃에서 1 min으로 35 cycle을 실행하였다. 그 후 1% agarose gel에 SYBRTM Safe DNA Gel Stain (Invitrogen, USA)을 첨가하여 100 V 30 min 동안 전기 영동을 진행한 후 UV를 조사하여 밴드를 확인하였다.

10. 통계처리

모든 실험을 3회 반복하였으며, Mean±SD로 나타내었다. 실험 결과 데이터는 Graphpad Prism software (version 5.00, USA)를 사용하여 one way ANOVA와 Tukey’s test를 실시하여 유의성을 검증하여 나타내었다.

Results and Discussion

1. 세포 생존율 측정 결과

MTT assay는 MTT 처리 시 세포 내 미토콘드리아에 존재하는 탈수소효소에 의한 tetrazolium의 고리구조가 파괴되어 자주색의 비수용성 formazan 결정으로 환원되는 원리를 이용한 실험이다(Ukeda et al., 1997). 따라서 RAW 264.7 cells와 HaCaT cells에 대한 SCR의 세포 생존율은 MTT assay를 이용하여 확인하였다(Figure 1). RAW 264.7 cells에 SCR을 처리한 결과 25-200 μg/mL 농도에서 세포가 80% 이상 생존하였다 (Figure 1A). HaCaT cells에 SCR을 처리한 결과 25-100 μg/mL에서 세포가 80% 이상 생존하였으며(Figure 1B), 이후 세포 실험에서는 80% 이상 생존율을 보이는 농도에서 실험을 진행하였다.

2. Collagenase 저해활성 및 Type Ⅰ collagen 생합성 측정 결과

피부는 상처나 염증성 질환 등의 이유로 약화되거나 조직이 무너지게 되면 각질형성세포와 진피섬유아세포에서 콜라겐 생성이 유도되어 손상된 피부 조직의 구조를 재건하는 데 도움을 준다(Cioce et al., 2024; Martin et al., 2015). Type I collagen은 손상된 조직의 재생에 중요한 extracellular matrix (ECM) 성분으로, 상처 치유와 피부 탄력 및 장벽 복구에 기여한다(Na et al., 2018; Cioce et al., 2024; Martin et al., 2015). 본 연구에서는 SCR이 collagenase 저해활성과 Type Ⅰ collagen 합성에 미치는 영향을 확인하였다(Figure 2). SCR이 농도 의존적으로(25-100 μg/mL) collagenase 저해활성을 증가를 확인하였다(Figure 2A). 또한, SCR은 50-100 μg/mL 농도 범위에서 Type Ⅰ collagen 생합성 증가를 나타내었으며, 특히 100 μg/mL에서(109.38%) 유의한 증가를 확인하였다(Figure 2B). SCR은 collagenase저해활성과 Type I collagen 생합성을 유도하여 상처 치유, 피부 탄력 및 장벽 복구에 도움을 줄 것으로 판단된다.

3. MMP-1 단백질 및 mRNA 발현 측정 결과

Matrix metalloproteinases (MMPs)는 피부의 각질형성세포, 섬유아세포 등의 세포로부터 분비되며, 세포내의 특정 단백질을 분해 및 재구성하거나, 세포 전이, 혈관 형성 등 중요한 역할을 한다(Na et al., 2018; Kim et al., 2023). MMPs 중 matrix metalloproteinases-1 (MMP-1)은 collagenase 1으로 불리며, 콜라겐 Type I과 III를 기질로 하고 있으며(Jo & Choi, 2023; Song et al., 2018), MMP-1을 억제하는 것은 Type I collagen 분해를 감소시켜 피부 결합조직의 탄력을 유지하는 데 도움을 준다(Jo & Choi, 2023). 본 연구에서는 SCR이 MMP-1 생성에 미치는 영향을 확인하기 위하여 RT-PCR과 western blot을 이용하여 확인하였다(Figure 3). SCR이 MMP-1 mRNA 발현에 미치는 영향을 확인한 결과, 100 μg/mL에서 25.21% 발현을 억제하였다(Figure 3A). 또한, SCR은 농도 의존적으로(25-100 μg/mL) MMP-1 단백질 발현 감소를 나타내었으며, 특히 100 μg/mL에서 63.14%로 발현이 유의적으로 억제되는 것을 확인하였다(Figure 3B). 따라서 SCR은 단백질 수준과 mRNA 수준에서 MMP-1의 일관적인 저해 효과가 관찰되어 피부 결합조직의 탄력을 유지에 관여하는 것으로 확인되었다.

4. 피부 장벽 단백질 발현 측정 결과

피부장벽은 각질형성세포의 분화 촉진 인자에 의해 형성되며, 손상 시 보호 기능이 약화되어 피부 건조증과 다양한 피부 질환을 유발할 수 있다. 특히 FLG, IVL, LOR의 발현이 감소하면 피부 장벽 기능이 저하되어 아토피피부염 및 건선과 같은 질환이 발생할 수 있다(Oh & Jang, 2015; Yu et al., 2015). 본 연구에서는 SCR이 피부 장벽 단백질 발현에 미치는 영향을 RT-PCR을 통해 확인하였다(Figure 4). 각질형성세포 분화 촉진에 관여하는 calcium은 피부장벽 기능 강화에 관련된 인자들의 발현 분석에 1.5 mM calcium chloride (CaCl₂)를 양성대조군으로 사용하였다(Yu et al., 2015). SCR은 농도 의존적으로(25-100 μg/mL) FLG, IVL 및 LOR 발현을 증가하였다. 특히, 100 μg/mL일 때, FLG (130.92%), IVL (161.16%) 및 LOR (211.22%)의 최대 발현 증가를 확인하였다. 본 연구결과를 통해 SCR은 피부장벽 단백질을 조절하여 장벽 기능 강화에 도움을 줄 가능성이 있다고 판단된다.

5. NO 생성능 측정 결과

NO는 세포가 cytokine 자극이나 미생물 감염에 반응하여 활성화될 때, NO 합성 효소인 NOS에 의해 L-arginine으로부터 생성되는 무기 자유 라디칼이다(Lee et al., 2016b). 대식세포인 RAW 264.7 cells는 LPS에 의한 자극으로 많은 양의 NO를 생성하며, 과도한 NO는 면역 반응, 세포 독성, 신경 전달, 혈관 확장 등 다양한 생물학적 과정에 관여한다(Yang et al., 2014; Jeong et al., 2012). NO는 농도에 따라 세포 기능 유지에 중요한 역할을 하기도 하지만 과다 생성 시 조직 손상 및 유전자 변이, 종양 형성 등의 부작용을 초래한다(Yang et al., 2014; Kim et al., 2022). 따라서, LPS로 유도된 RAW 264.7 cells에 대한 SCR의 NO 생성 억제 효과를 확인하고자 하였다. SCR은 농도 의존적으로(25-200 μg/mL) NO 생성을 감소하였다(Figure 5). 특히 200 μg/mL 농도에서 74.38% 저해 활성을 나타냈다.

6. iNOS, COX-2 단백질 발현 측정 결과

Nitric oxide synthase (NOS)는 세 가지 형태로 존재하는데, endothelial NOS (eNOS), neuronal NOS (nNOS)는 정상적인 세포에서 발현되고, inducible NOS (iNOS)는 LPS나 염증성 사이토카인에 의해 발현된다. 과잉 발현된 iNOS는 NO 생성을 촉진하여 염증 반응을 증가시킨다(Kim et al., 2012a; Jang & Hwangbo, 2023). Cyclooxygenase (COX)는 arachidonic acid을 prostaglandin으로 전환하는 효소로, COX-1은 대부분의 조직에서 항상성 유지에 관여하지만, COX-2는 면역반응 시 세포 내 발현이 증가하며 열, 통증 등의 염증 반응을 유발한다(Kim et al., 2022; Jang & Hwangbo, 2023). NO, COX-2, 염증성 사이토카인 등 염증매개인자들의 증가는 피부 염증을 발생시키고, 피부 장벽 기능의 장애를 유발할 수 있다(Lee et al., 2016a). 본 연구에서는 SCR이 iNOS와 COX-2 발현에 미치는 영향을 확인하기 위하여 western blot을 진행하였다(Figure 6). SCR은 농도 의존적으로(25-200 μg/mL) iNOS와 COX-2 단백질 발현을 감소하였다. 특히, SCR 200 μg/mL에서 iNOS은 51.64% 감소와 COX-2 80.2% 감소를 나타내었다. 본 연구결과를 통해 SCR이 NO 생성에 관여하는 iNOS와 COX-2 발현을 억제시킴으로써 피부 장벽의 염증을 조절할 수 있을 것으로 판단된다.

7. 염증성 사이토카인 발현 측정 결과

Interleukin-1β (IL-1β)는 선천 면역체계에서 생성되는 사이토카인으로 염증 반응의 중요한 매개체로서 감염 및 손상에 대한 생체 방어에 기여하고, interleukin-6 (IL-6)는 염증 반응을 조절하여 면역 항상성 유지에 도움을 준다(Shin et al., 2023). Tumor necrosis factor-α (TNF-α)는 종양세포의 괴사뿐만 아니라 염증 반응을 조절해 생체 내 항상성을 유지하며, 염증성 사이토카인의 과잉 발현은 자가면역질환, 조직 손상, 암 등의 원인이 될 수 있다(Jang & Hwangbo, 2023; Shin et al., 2023). 이러한 염증성 사이토카인의 과도한 발현은 아토피 피부염, 건선과 같은 다양한 염증성 피부 질환을 초래할 수 있으므로, 이들의 발현을 적절히 조절하는 것은 중요하다(Kim et al., 2023). 따라서 SCR이 염증성 사이토카인의 발현에 미치는 영향을 RT-PCR을 통해 확인하였다(Figure 7). SCR은 농도 의존적으로(25-200 μg/mL) 사이토카인의 발현을 억제시키는 것을 확인하였다. 따라서 SCR이 NO 생성 억제, iNOS 및 COX-2 발현 억제, 사이토카인 생성 억제를 통해 효과적인 염증 조절 소재로 활용할 수 있음을 시사한다.

Conclusion

본 연구에서는 Smilax china 에탄올 추출물(SCR)이 피부장벽 강화 효과와 항염증 효과를 통해 아토피 피부염 완화 소재로서의 가능성을 확인하고자 하였다. MTT assay에 의해 SCR에 대한 세포 생존율을 확인하였으며, HaCaT cells은 25-100 μg/mL 농도 범위에서, RAW 264.7 cells은 25-200 μg/mL 농도 범위에서 세포가 생존하였다. SCR은 collagenase 효소를 억제하고, HaCaT cells에서 Type Ⅰ collagen의 생합성 촉진 및 MMP-1의 발현을 억제함으로써, SCR이 손상된 피부 조직의 재생에 기여할 수 있는 가능성을 보여주었다(Jo & Choi, 2023). 또한 SCR은 피부 장벽 기능에 중요한 FLG, IVL, LOR의 mRNA 발현을 유의하게 증가시켰다. 이러한 결과는 SCR이 피부장벽 강화 및 복구에 효과적일 것으로 판단된다. NO는 적절한 농도에서 세포의 기능 유지에 관여하지만 과도한 NO 생성은 조직 손상과 유전자 변이, 종양 형성 등의 부작용을 초래할 수 있다(Kim et al., 2023; Kim et al., 2022). SCR은 NO 생성을 농도의존적으로 억제하였으며, iNOS, COX-2 단백질 발현을 억제하였다. 뿐만 아니라 SCR은 IL-1β, IL-6, TNF-α와 같은 염증성 사이토카인의 발현을 유의적으로 억제하였다. 즉, SCR은 콜라겐 합성을 촉진하고 피부 장벽 단백질을 증가시켜 피부 장벽 기능을 강화하며, 염증매개인자를 조절하여 항염증 효과를 나타내는 것으로 확인되었다. 특히 손상된 피부 장벽과 염증이 특징인 아토피 피부염을 개선하려면 염증 매개인자를 억제하여 피부 장벽 손상을 완화하는 것이 중요하다(Lee et al., 2016a). 따라서 염증 매개인자들인 NO, iNOS 및 COX-2 발현 억제 그리고 IL-1β, IL-6, TNF-α와 같은 염증성 사이토카인을 억제하는 것이 피부 장벽의 항상성 유지와 염증성 질환 완화에 필수적이다(Kim et al., 2012a; Kim et al., 2022; Koo et al., 2023). 따라서, 본 연구를 통해 SCR은 염증성 피부질환 완화에 도움을 줄 수 있는 천연 소재로서의 가능성이 확인되었으며, 특히 화장품 산업에서 아토피 피부염 완화에 도움이 되는 기능성 소재로 활용될 잠재력이 높다고 판단된다.

NOTES

Author's contribution

IHC designed all the experimental investigations. Biological activity experiments were conducted together by HMJ, and IHC oversaw the project and contributed to all aspects of analysis and experimental design.

Author details

Hyeon Mi Jo (Graduate Student), Department of Biomaterials Science, Gyeongsang National University, 33 Dongjin-ro, Jinju, Gyeongsangnam-do, 52725, Korea; In Ho Choi (Professor) Department of Plant and Biomaterials Science, Gyeongsang National University, 33 Dongjin-ro, Jinju, Gyeongsangnam-do, 52725, Korea.

Figure 1.

Effects of Smilax china ethanol extract on cell viability in RAW 264.7 and HaCaT cells.

RAW 264.7 cells (A) and HaCaT cells (B) were treated with SCR (25–400 μg/mL) for 24 h. Cell viability was determined using an MTT assay. The untreated control (con) response is expressed as 100%. Each value represents the mean±SD of three independent experiments.^***p<0.001 compared with the untreated control. SCR, Smilax china ethanol extract.

Figure 2.

Effects of Smilax china ethanol extract on collagenase inhibition activity and collagen synthesis.

(A) Inhibition effect of SCR (25-100 μg/mL) on collagenase activity. (B) HaCaT cells were treated with the SCR (25-100 μg/mL) for 24h. The conditioned medium was subjected to collagen synthesis analysis using a procollagen type I C-peptide (PIP) EIA kit. Each value represents the mean±SD of three independent experiments. ^*p<0.05, ^***p<0.001 compared with the untreated control (con). SCR: Smilax china ethanol extract.

Figure 3.

Effects of Smilax China ethanol extract MMP-1 inhibition in HaCaT cells.

HaCaT cells were incubated with various concentrations of SCR (25-100 μg/mL) for 1 h, followed by incubation with or without tumor necrosis factor-α (TNF-α; 10 ng/mL) for 24 h. (A) RT-PCR was used to determine the level of MMP-1 mRNA. (B) MMP-1 protein levels were determined using western blotting. Each value represents the mean±SD of three independent experiments. ^#p<0.05 compared with the untreated control, ^*p<0.05 compared with TNF-α. SCR, Smilax china ethanol extract.

Figure 4.

Effects of Smilax china ethanol extract on mRNA expression of filaggrin, involucrin and loricrin in HaCaT cells.

HaCaT cells were incubated with various concentrations of SCR (25-100 μg/mL) for 24 h. CaCl₂ (1.5 mM) was used as the positive control. The mRNA expression levels of FLG (B), IVL (C), and LOR (D) were determined using RT-PCR. The untreated control (con) response is expressed as 100%. Each value represents the mean±SD of three independent experiments. ^*p<0.05 compared with the untreated control (con). SCR, Smilax china ethanol extract.

Figure 5.

Effects of Smilax china ethanol extract on nitric oxide (NO) production in LPS-induced RAW264.7 cells.

RAW 264.7 cells were incubated with various concentrations of SCR (25-200 μg/mL) for 1 h, followed by LPS (1 μg/mL) for 24 h. Then the levels of NO production in the conditioned media were determined. Each value represents the mean±SD of three independent experiments. ^#p<0.05 compared with the untreated control; ^***p<0.001 compared with LPS. SCR, Smilax china ethanol extract.

Figure 6.

Effects of Smilax china ethanol extract on iNOS, COX-2 protein expression levels in LPS-induced RAW264.7 cells.

RAW 264.7 cells were incubated with various concentrations of SCR (25-200 μg/mL) for 1 h, followed by LPS (1 μg/mL) for 24 h. The protein expression levels of (A) iNOS and (B) COX-2 were determined using western blotting. Each value represents the mean±SD of three independent experiments. ^#p<0.05 compared with the untreated control, ^*p<0.05, ^***p<0.001 compared with LPS. SCR, Smilax china ethanol extract.

Figure 7.

Effects of Smilax china ethanol extract on mRNA expression of proinflammatory cytokines in RAW 264.7 cells.

RAW 264.7 cells were incubated with various concentrations of SCR (25-200 μg/mL) for 1 h, followed by lipopolysaccharide (LPS; 1 μg/mL) for 6 h. Then the mRNA levels of (B) interleukin-1β (IL-1β), (C) interleukin-6 (IL-6), and (D) tumor necrosis factor-α (TNF-α) were determined using RT-PCR. Each value represents the mean±SD of three independent experiments. ^#p<0.05 compared with the untreated control; ^**p<0.01, ^***p<0.001 compared with LPS. SCR, Smilax china ethanol extract.

Table 1.

Sequences of target gene-specific primers used for RT-PCR assay

Target gene	Direction	Primer sequence
Interleukin-1β	Forward	5’-AGACAGCTCAATCTCCAGGG-3’
Interleukin-1β	Reverse	5’-GGCAAGGAGGAAAACACAGG-3’
Interleukin-6	Forward	5’-CGCTATGAAGTTCCTCTCTGC-3’
Interleukin-6	Reverse	5’-GTTGTCACCAGCATCAGTCC-3’
Tumor necrosis factor-α	Forward	5’-CAGGCGGTGCCTATGTCTC-3’
Tumor necrosis factor-α	Reverse	5’-CGATCACCCCGAAGTTCAGTAG-3’
Filaggrin	Forward	5’-CCGGCTTGGCCGTAATGTGT-3’
Filaggrin	Reverse	5’-AGGAAGATCCAAGAGCCCA-3’
Involucrin	Forward	5’-GGTCCCATCAAAGCAAGAGG-3’
Involucrin	Reverse	5’-TGCTCACATTCTTGCTCAGG-3’
Loricrin	Forward	5’-CACTGGGGTTGGGAGGTAGT-3’
Loricrin	Reverse	5’-GCTCTCATGATGCTACCCGA-3’
GAPDH (mouse)	Forward	5’-CAAGAAGGTGGTGAAGCAGG-3’
GAPDH (mouse)	Reverse	5’-ATCGAAGGTGGAAGAGTGGG-3’
GAPDH (human)	Forward	5’-CAAGAAGGTGGTGAAGCAGG-3’
GAPDH (human)	Reverse	5’-GTCAAAGGTGGAGGAGTGGG-3’

GAPDH, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase.

References

Bak SG, Lim HJ, Won YS, Park EJ, Oh JH, Kim JE, Lee MJ, Lee S, Lee SW, Lee SJ, et al. Effect of Ampelopsis brevipedunculata (Maxim.) Trautv extract on skin barrier function. Food and Life 2023: 13-18. 2023.

Cioce A, Cavani A, Cattani C, Scopelliti F. Role of the skin immune system in wound healing. Cells 13: 624. 2024.

Hänel KH, Cornelissen C, Lüscher B, Baron JM. Cytokines and the skin barrier. International Journal of Molecular Sciences 14: 6720-6745. 2013.

Hong CE, Lyu SY. Effects of three Korean white ginseng extracts on atopic dermatitis-related cytokines, antioxidant and anti-aging activities. Korean Journal of Pharmacognosy 50: 102-111. 2019.

Jang EJ, Hwangbo MH. Anti-inflammatory effects of Jujube seed extracts. Culinary Science & Hospitality Research 29: 46-56. 2023.

Jeong H, Sung MS, Kim YH, Ham H, Choi YM, Lee J. Antiinflammatory activity of Salvia plebeia R. Br. leaf through heme oxygenase-1 induction in LPS-stimulated RAW 264.7 Macrophages. Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition 47: 888-894. 2012.

Jo HM, Choi IH. A study on antioxidant, pro-collagen synthesis and MMP-1 inhibitory activities of Salvia microphylla extract. Asian Journal of Beauty and Cosmetology 21: 665-674. 2023.

Kim CH, Lee MA, Kim TW, Jang JY, Kim HJ. Anti-inflammatory effect of Allium hookeri root methanol extract in LPS-induced RAW264.7 cells. Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition. 41: 1645-1648. 2012a.

Kim DS, Kim G, Sung NY, Han IJ, Kim MJ, Kim CS, Jung Y. Antioxidant, anti-inflammatory, and anti-wrinkle effects of Sargassum horneri extract in vitro. Asian Journal of Beauty and Cosmetology 21: 653-664. 2023.

Kim HJ, Lee FH, Shin JU. Atopic dermatitis and skin barrier dysfunction. Allergy Asthma & Respiratory Disease 1: 20-28. 2013.

Kim HM, Yoo DH, Lee IC. Verification of anti-inflammatory efficacy of apple mango (Mangifera indica L.) peel in LPS-activated Macrophage. Microbiology and Biotechnology Letters 50: 337-346. 2022.

Kim YS, Lee SJ, Hwang JW, Kim EH, Park PJ, Jeong JH. Anti-inflammatory effects of extracts from Ligustrum ovalifolium H. leaves on RAW264.7 macrophages. Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition. 41: 1205-1210. 2012b.

Koo HJ, Kim SH, Ha CW, Jang SH, Choi JH, Lim JD, Sohn EH. Aqueous extract of Allium victorialis var. Platyphyllum Rhizome improves skin barrier and suppresses inflammation. Korean Journal of Medicinal Crop Science 31: 169-179. 2023.

Kwon HJ, Lee GS, Kim JH, Kwon SW, Hwang HS. Study on skin anti-inflammatory activity of fig (Ficus carica L.) fruit extract fractions. Journal of Applied Biological Chemistry 66: 416-423. 2023.

Lee CW, Lin ZC, Hu SCS, Chiang YC, Hsu LF, Lin YC, Lee IT, Tsai MH, Fang JY. Urban particulate matter down-regulates filaggrin via COX2 expression/PGE₂ production leading to skin barrier dysfunction. Scientific Reports 6: 27995. 2016a.

Lee KJ, Seo HM, Lee SA, Kin JH, Kim HL. Antioxidant activity, total polyphenol content, and total flavonoid content of Boehmeria nivea var. tenacissima (Gaudich.) Miq. collected from six regions. Korean Journal of Plant Resources 36: 1-14. 2023.

Lee SH, Kwak CH, Lee SK, Ha SH, Park J, Ha SH, Chung TW, Ha KT, Suh SJ, Chang YC, Chang HW, et al. Anti-inflammatory effect of ascochlorin in LPS-stimulated RAW 264.7 macrophage cells is accompanied with the downregulation of iNOS, COX-2 and proinflammatory cytokines through NF-κB, ERK1/2, and p38 signaling pathway. Journal of Cellular Biochemistry. 117: 978-987. 2016b.

Lee SY, Yoo DH, Joo DH, Jo HS, Lee JY. Inhibitory efficacy of Smilax china L. on MITF, TRP-1, TRP-2, tyrosinase protein and mRNA expression in melanoma cell (B16F10). Microbiology and Biotechnology Letters. 44: 1-8. 2016c.

Martin P, Nunan R. Cellular and molecular mechanisms of repair in acute and chronic wound healing. The British Journal of Dermatology 173: 370-378. 2015.

Na EJ, Yang HO, Choi YE, Han HS, Rhie SJ, Ryu JY. Antiinflammatory and collagen production effect of syringic acid on human keratinocyte (HaCaT) damaged by ultraviolet B. Asian Journal of Beauty and Cosmetology 16: 523-531. 2018.

Oh JS, Jang HH. Epidermal differentiation and skin barrier. Asian Journal of Beauty and Cosmetology 13: 713-720. 2015.

Orecchioni M, Ghosheh Y, Pramod AB, Ley K. Macrophage polarization: different gene signatures in M1 (LPS+) vs. classically and M2 (LPS-) vs. alternatively activated macrophages. Frontiers in Immunology. 10: 1084. 2019.

Park JS, Kwon HJ. Antimicrobial activity against Propionibacterium acnes bacteria of Smilacis glabrae Rhizoma extracts. Journal of the Korea Convergence Society 8: 425-430. 2017.

Sandilands A, Sutherland C, Irvine AD, McLean WH. Filaggrin in the frontline: role in skin barrier function and disease. Journal of Cell Science 122: 1285-1294. 2009.

Shin S, Hong EJ, Lee JH, Kim KY, Choi JY, Kim KM. Antiinflammatory effects of immature pear extract through the regulation of MAPKs signaling pathway in LPS-induced inflammation in RAW 2647 macrophages. Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition 52: 1101-1110. 2023.

So YK, Hwang JY, Kim HW, Jo HN, Lee TB. Skin hydration and skin barrier effects of Cymbopogon citratus and Perilla frutescens extracts. Journal of the Society of Cosmetic Scientists of Korea 45: 225-235. 2019.

Song BW, Song MJ, Park MJ, Choi DH, Lee SS, Kim M, Hwang KC, Kim IK. Anti-wrinkle and whitening effects of essential oil from Abies koreana. Journal of Life Science 25: 524-531. 2018.

Song L, Tian L, Ma Y, Xie Y, Feng H, Qin F, Mo L, Lin S, Hou L, Wang C. Protection of flavonoids from Smilax china L. rhizome on phenol mucilage-induced pelvic inflammation in rats by attenuating inflammation and fibrosis. Journal of Functional Foods 28: 194-204. 2017.

Ukeda H, Maeda S, Ishii T, Sawamura M. Spectrophotometric assay for superoxide dismutase based on tetrazolium salt 3′-{1-[(Phenylamino)-carbonyl]-3,4-tetrazolium}-bis(4-methoxy-6-nitro)benzenesulfonic acid hydrate reduction by xanthine-xanthine oxidase. Analytical Biochemistry 251: 206-209. 1997.

Vijayalakshmi A, Ravichandiran V, Malarkodi V, Nirmala S, Jayakumari S. Screening of flavonoid "quercetin" from the rhizome of Smilax china Linn. for anti-psoriatic activity. Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine 2: 269-275. 2012.

Yang Y, Kim SC, Yu T, Yi YS, Rhee MH, Sung GH, Yoo BC, Cho JY. Functional roles of p38 mitogen-activated protein kinase in macrophage-mediated inflammatory responses. Mediators of Inflammation 2014: 352371. 2014.

Yu HY, Yang IJ, Lincha VR, Park IS, Lee DU, Shin HM. The effects of the fruits of Foeniculum vulgare on skin barrier function and hyaluronic acid production in HaCaT keratinocytes. Journal of Life Science 25: 880-888. 2015.