Evaluation of Antioxidant, Anti-inflammatory, Antimicrobial, and <i>In Vitro</i> Efficacy of <i>Actaea heracleifolia</i> Root Extract

Kim, Yeo Jin; Kim, Tae Eun; Han, Chae Hyun; Kim, Kwang Hee; Ryu, Hee Wook; Yeo Jin Kim; Tae Eun Kim; Chae Hyun Han; Kwang Hee Kim; Hee Wook Ryu

doi:10.20402/ajbc.2025.0022

Asian J Beauty Cosmetol > Volume 23(1); 2025 > Article

서양 승마(Actaea heracleifolia) 뿌리 추출물의 항산화, 항염, 항균 및 In Vitro 효능 평가

Research Article

Asian J Beauty Cosmetol 2025; 23(1): 167-178.

Published online: February 27, 2025

DOI: https://doi.org/10.20402/ajbc.2025.0022

서양 승마(Actaea heracleifolia) 뿌리 추출물의 항산화, 항염, 항균 및 In Vitro 효능 평가

김여진, 김태은, 한채현, 김광희, 류희욱^*

숭실대학교 화학공학과, 서울, 한국

Evaluation of Antioxidant, Anti-inflammatory, Antimicrobial, and In Vitro Efficacy of Actaea heracleifolia Root Extract

Yeo Jin Kim, Tae Eun Kim, Chae Hyun Han, Kwang Hee Kim, Hee Wook Ryu^*

Department of Chemical Engineering, Soongsil University, Seoul, Korea

大三叶升麻根提取物的抗氧化、抗炎、抗菌及体外功效评价

金呂眞, 金泰蒑, 韓采見, 金侊姬, 柳熙旭^*

崇实大学化学工程科，首尔，韩国

^*Corresponding author: Hee Wook Ryu, Department Chemical Engineering, Soongsil University, 369, Sangdo-ro, Dongjak-gu, Seoul 06978, Korea Tel.: +82 2 820 0611 Email: hwryu@ssu.ac.kr

Received February 8, 2025 Revised February 17, 2025 Accepted February 26, 2025

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요약

목적

기능성 천연물질로 서양 승마 뿌리 추출물의 활용 가능성을 규명하기 위하여 항산화능, 총 폴리페놀 함량과 총 플라보노이드 함량, 항균효과, 세포독성, 산화질소 생성 억제활성, elastase 활성억제활성, hMMP-1 저해활성 등을 연구하였다.

방법

건조된 서양 승마 뿌리는 분쇄 후 메탄올로 추출한 뒤 동결건조 추출물로 최종 준비되었다. 분석을 위해 자유라디칼 소거능, 폴리페놀 및 플라보노이드 함량 측정, 황색포도상구균 성장 억제 측정, 세포 배양 후 생존율 측정, 염증성 사이토카인 측정 등이 이루어졌다.

결과

서양 승마 뿌리 추출물의 ABTS 및 DPPH 라디칼 소거능은 5,000 μg/mL 농도에서 각각 99.6%와 94.2% 이었고, 총 폴리페놀 함량과 총 플라보노이드 함량은 각각 92±31 mg/g extract와 3.5±0.3 mg/g extract 이었다. 뿌리 추출물은 1,000 μg/mL에서 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)의 생장을 43.5% 억제하였다. 뿌리 추출물은 RAW 264.7 세포에 대한 세포 독성이 관찰되지 않았다. 또한, 추출물은 100 μg/mL에서 TNF-α 발현 억제 효율이 55.3% 이었고, NO 발현은 무자극의 대조군과 거의 유사할 정도로 억제하였다. 뿌리 추출물은 1,000 μg/mL 농도에서 elastase 활성억제 효능이 약 43.02% 이었고, HDFs 세포의 hMMP-1 발현을 100 μg/mL에서 약 89.1% 억제하였다.

결론

본 연구 결과는 서양 승마 뿌리 추출물이 항산화능, 총 폴리페놀 함량과 총 플라보노이드 함량, 항균효과, 세포독성, 산화질소 생성 억제활성, elastase 활성억제활성, hMMP-1 저해활성 등이 우수한 기능성 천연소재 중 하나임을 의미한다.

핵심용어: 서양 승마, 항균, 항산화, 항염, 효능

Abstract

Purpose

This study investigated the potential of Actaea heracleifolia root extract as a functional natural material by analyzing its effects on antioxidant and anti-bacterial effect activity; polyphenol and flavonoid content; cytotoxicity; and nitric oxide (NO), elastase, and human matrix metalloproteinase-1 (hMMP-1) production.

Methods

Dried A. heracleifolia roots were ground, extracted with methanol, and freeze-dried. Various assessments were conducted, including assessments of free radical scavenging, polyphenol and flavonoid content, Staphylococcus aureus growth inhibition, cell viability, and inflammatory cytokine production.

Results

The ABTS and DPPH scavenging activities of the extract at 5,000 μg/mL were 99.6% and 94.2%, respectively. The total polyphenol and flavonoid levels were 92.3 and 3.5 mg/g extract, respectively. The extract inhibited S. aureus growth by 43.5% at 1,000 μg/mL. No cytotoxicity was observed in RAW 264.7 cells. At 100 μg/mL, the extract reduced TNF-α expression by 55.3%, and NO production was almost completely suppressed. Elastase production was reduced by 43.0% at 1,000 μg/mL, and the extract at 100 μg/mL decreased hMMP-1 expression in HDF cells by 89.1%.

Conclusion

Based on its biological activities, A. heracleifolia root extract exhibits promise as functional natural material.

Keywords: Actaea heracleifolia, Antimicrobial, Antioxidant, Anti-inflammatory, In vitro

中文摘要

目的

本研究通过分析大三叶升麻根提取物对抗氧化和抗菌活性、多酚和黄酮类化合物含量、细胞毒性以及一氧化氮 (NO)、弹性蛋白酶和人基质金属蛋白酶-1 (hMMP-1)产生的影响，探究了大三叶升麻根提取物作为功能性天然材料的潜力。

方法

将干燥的大三叶升麻根研磨，用甲醇提取，然后冷冻干燥。进行了各种评估，包括自由基清除、多酚和黄酮类化合物含量、金黄色葡萄球菌生长抑制、细胞活力和炎性细胞因子产生。

结果

浓度为5,000 μg/mL的提取物的ABTS和DPPH清除活性分别为99.6%和94.2%。总多酚和黄酮类化合物水平分别为92.3和3.5 mg/g extract。浓度为1,000 μg/mL的提取物可抑制金黄色葡萄球菌生长43.5%。在RAW 264.7 细胞中未观察到细胞毒性。浓度为100 μg/mL的提取物可使TNF-α表达降低55.3%，NO产生几乎完全被抑制。浓度为1,000 μg/mL的提取物可使弹性蛋白酶产生减少43.0%，浓度为100 μg/mL的提取物可使HDF细胞中的hMMP-1表达降低89.1%。

结论

基于其生物活性，大三叶升麻根提取物展现出作为功能性天然材料的前景。

关键词: 大三叶升麻, 抗菌, 抗氧化, 消炎, 功效

Introduction

고령화 사회로 진입이 본격화됨에 따라, 건강한 삶을 위한 건강 유지, 안티에이징 등에 대한 사회적 관심이 높다. 이에 따라 인체에 안전한 천연 소재의 생리활성 물질을 활용하는 연구가 광범위하게 진행되고 있다(Han et al., 2018). 특히, 플라보노이드를 비롯한 폴리페놀 및 카로티노이드, 사포닌 등의 각종 기능성 유기물이나 무기물을 다량 함유한 약용식물을 활용한 약재, 화장품, 식품에 관한 연구가 활발히 진행되고 있다(Platzer et al., 2021). 특히, 한류로 인해 국내에서 생산되는 한방 화장품을 비롯하여 천연 소재를 이용한 기능성 화장품에 관한 관심이 높아지면서, 피부에 대한 안전성과 무해성이 입증된 약용식물의 성분을 활용한 관련 연구가 중요하게 부각하고 있다(Betz et al., 2009).

약용식물 중 하나인 서양 승마(Actaea heracleifolia)는 해발 1,600 m 대서양 연안에 자생하는 미나리 재비과(Ranunculaceae) 허브로, 미국을 비롯한 국내 및 중국, 유럽에서 널리 사용되고 있는 약재 중 하나이다(Huntley & Ernst, 2003). 특히, 약재로서 효능이 있는 서양 승마 뿌리는 isoflavone의 에스트로겐을 비롯한 다양한 화학적·생물학적 생체 활성화 성분을 함유하고 있어 갱년기 우울증, 임신 장애, 안면홍조, 수면장애, 발한, 신경과민증 등(Kim et al., 2023; Kyazimova & Kornyakova, 2024)과 해열제 및 해독제, 항염증제, 항알레르기 등에 효과가 있다(Kim et al., 2011a; Li et al., 2024; Ray et al., 2023).

승마 뿌리 추출물에 함유된 27-deoxyactein, triterpene glycoside, caffeic acid, isoferulic acid, fukinolic acid 등의 약재 성분(Tumsutti et al., 2022)은 항산화 및 주름 개선(Leach & Moore, 2012), 피부 진정 및 보습(Manuhara et al., 2022), 여드름 완화(Kotnala et al., 2019), 피부 미백(Dwivedi & Jhade, 2021) 등의 기능성 화장품 개발에 활용된다. 이에 국내 자생종 승마 추출물을 활용한 기능성 화장품 개발에 관한 연구가 진행되고 있다. 그러나 서양 승마 추출물을 활용한 연구는 매우 제한적이며, 무엇보다 피부에 미치는 영향에 대한 신뢰성 검증 관련 연구는 매우 부족한 실정이다(Mutha et al., 2021).

본 연구에서는 기능성 화장품의 원료로 서양 승마 뿌리의 사용 가능성을 평가하였다. 서양 승마 뿌리의 메탄올 추출물을 대상으로 항산화 활성, 총 폴리페놀 함량, 총 플라보노이드 함량, 세포 독성, 항균, 항염, 주름 개선 효과 등을 규명하였다.

Methods

1. 재료 및 방법

1) 서양 승마 시료 준비 및 추출

실험에 사용한 서양 승마 뿌리는 ㈜동진코스팜(Dong jin Korsfarm, Korea)에서 건조된 것을 구입하여 실험에 사용하였다. 서양 승마 뿌리는 블렌더(HMF-3260S; Hanil, Korea)를 이용해 분쇄한 후 200 g의 분쇄 시료를 70% 메탄올(Samjeon, Korea) 수용액 1 L에 침지하여 상온에서 24 h 동안 추출하였다. 이후 고형물질과 여과액을 분리하고 공비 농축하여 잔류 메탄올을 제거한 뒤, 72 h 동안 동결 건조(PVTFD20R; ILSHIN, Korea)하였다. 서양 승마 뿌리 200 g을 메탄올로 추출 후 동결건조하여 26.1 g의 추출물을 얻었고, 추출 수율은 약 13%이었다. 동결 건조한 추출물은 10% DMSO의 증류수에 용해시켜 10 mg/mL 농도의 저장용액(stock solution)을 제조하여 실험에 사용하였다.

2) 서양 승마 뿌리 추출물의 ABTS 라디칼 소거 측정

서양 승마 뿌리 추출물의 항산화 활성은 2,2’-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt (ABTS; Sigma-Aldrich, USA) assay로 자유라디칼 소거능을 분석하였다(Riahi et al., 2016). 먼저, 7 mM ABTS 용액(Sigma-Aldrich)과 2.6 mM potassium persulphate 용액(Sigma-Aldrich)을 부피 비로 1:1로 혼합하여 상온의 어두운 곳에서 12 h 동안 방치하여 ABTS working solution을 제조하였다. 625, 1,250, 2,500, 5,000, 10,000 μg/mL 농도의 서양 승마 뿌리 추출물 10 μL를 ABTS working solution 200 μL에 추가하였다. 상온에서 30 min 동안 반응시킨 후, Microplate reader (Synergy HTX; BioTech, USA)를 이용해 734 nm에서 흡광도를 측정하였다. 공시료액 반응에서는 시료 10 μL를 에탄올 200 μL와 혼합하여 반응시킨 후, 흡광도를 측정하여 ABTS 라디칼 소거율을 구하였다.

3) 서양 승마 뿌리 추출물의 DPPH radical 소거 측정

서양 승마 뿌리 추출물에 의한 항산화 활성을 확인하기 위해 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH; Sigma-Aldrich)를 이용하여 자유라디칼 소거능을 분석하였다(Jo et al., 2020). 0.2 mM DPPH 라디칼 용액 200 μL에 서양 승마 뿌리 추출물을 625, 1,250, 2,500, 5,000, 10,000 μg/mL 시험 농도 범위에서 10 μL를 첨가하고, 상온에서 30 min 동안 반응시켰다. 이후, 반응액의 흡광도를 Microplate reader (Synergy HTX; BioTek)를 이용하여 517 nm에서 측정하였다. 공시료액 반응에서는 시료 10 μL를 에탄올 200 μL와 혼합하여 반응시킨 후, 흡광도를 측정하여 DPPH 라디칼 소거율을 구하였다.

4) 서양 승마 뿌리 추출물의 총 폴리페놀 함량 측정

서양 승마 뿌리 추출물의 총 폴리페놀 함량은 Folin-Ciocalteus 시약(Sigma-Aldrich)을 사용하여 측정하였다. 서양 승마 뿌리 추출물 10 μL에 2% Na₂CO₃용액 10 μL를 첨가하여 알칼리 조건을 만든 후, 3 min 동안 반응시켰다. 그 후, 50% Folin-Ciocalteu 시약 200 μL를 추가하고 30 min 동안 반응시킨 뒤, 750 nm에서 흡광도를 측정하였다. 총 폴리페놀 함량은 표준 물질인 gallic acid를 이용하여 얻은 검량선을 작성한 것으로 정량화 하였다.

5) 서양 승마 뿌리 추출물의 총 플라보노이드 함량 측정

서양 승마 뿌리 추출물의 총 플라보노이드 함량은 Aluminium chloride colorimetric method (Chang et al., 2002)로 분석하였다. 서양 승마 뿌리 추출물 86 μL와 5% sodium nitrate (Sigma-Aldrich) 6 μL를 혼합하여 5 min 동안 반응시켰다. 반응액에 10% aluminum chloride (Sigma-Aldrich) 66 μL를 추가하고, 6 min 동안 반응시켰다. 1 M sodium hydroxide (Biosolution, Korea) 40 μL와 증류수 66 μL를 순서대로 첨가한 후, 520 nm에서 흡광도를 측정하였다. 총 플라보노이드 함량은 표준물질인 quercetin을 사용하여 얻은 검량선을 작성한 것으로 정량화 하였다.

6) 서양 승마 뿌리 추출물의 항균 효능 평가

서양 승마 뿌리 추출물의 항균 효능은 황색포도상구균(Staphylococcus aureus, ATCC 25923, American Type Culture Collection, USA)의 성장 억제를 통해 측정하였다. 1×10⁷ CFU/mL의 S. aureus 가 접종된 동일 양의 배지를 test tube에 분주한 후 서양 승마 뿌리 추출물을 250, 500, 1,000, 2,000 μg/mL 농도로 배지에 첨가하여 2, 4, 6, 8 h 동안 배양하였다. S. aureus 의 성장은 2 h 간격으로 배양액을 채취하여 600 nm에서 흡광도로 측정하였다. 양성 대조군으로는 gentamycin (Jeil Pharmaceutical, Korea) 1,000 μg/mL을 사용하여 실험군과 비교하였으며, 서양 승마 뿌리 추출물의 S. aureus 의 성장 억제율을 분석하여 항균 활성을 평가하였다.

7) 서양 승마 뿌리 추출물의 세포 독성 평가

서양 승마 뿌리 추출물의 세포 독성은 두 종류의 세포(RAW 264.7, HDF)를 배양하여 평가하였다. RAW 264.7 세포(ATCC TIB-71; American Type Culture Collection)는 75 cm² 세포 배양 플라스크에 Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM; Hyclone, USA)에 10% fetal bovine serum (FBS; Gibco, USA)과 100x penicillin-streptomycin (P/S; Biowest, France)을 포함한 배지에서 배양하였다. HDF 세포(human dermal fibroblasts; Gibco, USA)는 75 cm² 세포 배양 플라스크에서 RPMI 1640 배지에 10% fetal bovine serum (FBS)과 1% penicillin-streptomycin (P/S)을 포함하여 배양하였다. 두 세포주는 37℃, 5% CO₂ 환경에서 이틀마다 성장 배지를 교체하며 배양하였다. 세포 성장이 70% confluence에 도달하면, 서양 승마 뿌리 추출물의 효능평가를 위해 0.25% trypsin (Biowest, France)을 사용하여 플라스크에 부착된 세포를 분리하여 사용하였다.

서양 승마 뿌리 추출물이 세포에 미치는 독성 영향은 MTT assay를 사용하여 세포 생존율을 광학 밀도(optical density, OD)로 측정하여 분석하였다. RAW 264.7 세포는 3×10⁵ cell/mL 농도로 96 well plate에 접종한 후, 37℃, 5% CO₂ 환경에서 24 h 동안 안정화하였다. 안정화 후, RAW 264.7 세포배양 배지를 제거하고, FBS (Gibco) 없는 1% P/S가 포함된 DMEM 배지(Hyclone) 160 μL와 서양 승마 뿌리 추출물을 1, 10, 100 μg/mL 농도별로 20 μL씩 첨가하여 37℃, 5% CO₂ 환경에서 24 h 동안 배양하였다. 배양 후, 배양 상등액을 제거하고, 5,000 μg/mL 농도의 MTT 용액(Invitrogen, USA) 20 μL와 혈청이 없는 RAW 264.7 배양 배지 980 μL를 섞어 세포에 첨가하였다. 이후 30 min 동안 배양한 후, 550 nm에서 OD 값을 측정하여 세포 생존율을 평가하였다.

8)서양 승마 뿌리 추출물의 염증성 사이토카인 발현 측정(TNF-α)

서양 승마 뿌리 추출물의 염증 억제 효과를 평가하기 위해 세포 배양 상등액에서 유리된 염증성 사이토카인 TNF-α 함량을 sandwich ELISA법을 사용하여 측정하였다. 염증성 사이토카인 측정은 mouse TNF Alpha ELISA kit (Invitrogen)를 사용하였으며, LPS 1 μg/mL로 처리된 샘플에서 측정하였다. 염증 억제 효과를 평가하기 위해 dexamethasone (DEX)을 20 μg/mL 농도로 사용하였다. TNF-α의 함량은 kit 제조사에서 제공하는 lyophilized recombinant protein을 통해 작성된 표준 곡선으로 계산하였으며, 생성량은 pg/mL로 계산되었다. 서양 승마 뿌리 추출물의 농도별 염증성 사이토카인 억제 수준을 평가하기 위해 1, 10, 100 μg/mL 농도의 추출물을 세포에 처리하여 염증성 cytokine 억제 수준을 평가하였다.

9) 서양 승마 뿌리 추출물의 산화 질소 측정

서양 승마 뿌리 추출물의 산화질소(nitric oxide, NO) 함량은 Griess assay (Kim et al., 2002) 법을 사용하여 측정하였다. Griess reagent A (1 g, sulfanilamide Cat#S9251; Sigma-Aldrich)와 5 mL 85% phosphoric acid (Sigma-Aldrich) 및 0.1 g griess reagent B (N-(1-naphthyl)ethylenediamine dihydrochloride, Sigma-Aldrich)를 1:1 비율로 혼합하여 Griess reagent AB 혼합액을 준비하였다. 준비한 griess reagent AB 혼합액 50 μL와 세포배양 상등액 50 μL를 혼합하여, 37℃에서 15 min 동안 반응시킨 뒤 540 nm에서 OD 값을 측정하였다. NO의 함량은 sodium nitrite (Sigma-Aldrich)를 이용하여 μM로 정량화하였다.

10) 서양 승마 뿌리 추출물의 Elastase inhibitory assay 분석

서양 승마 뿌리 추출물의 elastase 억제 활성은 N-succinyl-trialanylp-nitroanilide (STANA; Sigma-Aldrich)를 사용한 효소 활성도 측정법을 이용하여 분석하였다. 96 well plate에 0.2 M Tris-HCl buffer (pH 8.0) 180 μL와 80 μL를 혼합한 서양 승마 뿌리 추출물은 1, 10, 100, 1,000 μg/mL 농도로 측정하여, 2 mM STANA 용액 20 μL를 첨가하였다. 이후 porcine pancreas로부터 유래한 0.1 U/mL 의 elastase (Sigma-Aldrich)를 20 μL 추가하여 37℃에서 10 min 동안 반응시켰다. 반응 후 410 nm에서 흡광도를 측정하여 elastase 억제 활성을 분석하였다.

11) 서양 승마 뿌리 추출물의 MMP-1 inhibition 분석

서양 승마 뿌리 추출물 0.01, 0.1, 1, 10, 100 μg/mL 농도로 처리한 후, MMP-1 발현 억제 활성은 진피 섬유아세포(normal human dermal fibroblasts, HDFs)에서 ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)방법을 이용하여MMP-1 ELISA set로 평가하였다. HDF 세포는 1×10⁵ cells/well (1 mL volume) 농도로 12 well plate에 분주하고, 10% FBS 및 1% P/S가 첨가된 RPMI 1640 배지에 24 h 동안 안정화하였다. FBS가 첨가되지 않은 RPMI 1640 배지로 교체한 후, 24 h 동안 추가로 안정화하였다. 세포를 1 mL PBS로 2회 세척 후, 200 μL PBS를 세포에 처리하고 20 mJ/cm²의 UVB (Multi Light Viewing Booth, Shinsungautomotive, Korea)를 조사하여 MMP-1의 발현을 유도하였다. UVB조사 후, PBS를 제거하고, FBS가 첨가되지 않은 RPMI 1640 배지 1 mL를 처리하여 24 h 동안 배양하였다. 배양 상등액을 회수한 뒤 collagenase의 생성량을 측정하였다. MMP-1의 생성량은 total MMP-1 ELISA set을 사용하여 측정하였으며, MMP-1 억제 분석은 recombinant MMP-1 protein으로 작성된 표준 곡선을 이용하여 진행하였다.

2. 통계 분석

본 실험 데이터는 각 항목에 대해 백분율과 평균±표준편차로 처리하였으며, 실험 결과의 통계적 분석은 Student's t-test를 사용하여 수행하였다. 대조군과 각 처리군 간의 유의성 차이는 p<0.05, p<0.01, p<0.001 수준에서 평가하였다.

Results and Discussion

1. 서양 승마 뿌리 추출물의 항산화 활성

서양 승마 뿌리 추출물의 농도 변화에 따른 항산화 활성은 Figure 1과 같다. ABTS 및 DPPH 라디칼 소거 분석법 모두 농도에 따라 항산화 활성이 증가하는 경향을 보였으며, 증가 속도는 다소 차이가 있었다. 추출물의 ABTS 라디칼 소거능은 농도가 증가함에 따라 2,500 μg/mL 까지 거의 선형적으로 증가하여 약 88.1%에 도달하였고, 5,000 μg/mL 이상에서는 99.6%에 달하였다. 반면, DPPH 라디칼 소거능 역시 농도 증가에 따라 증가하여 2,500 μg/m에서 약 93.2%를 기록하였으며며, 5,000 μg/mL에서는 약 94.2%의 소거능을 보였다. 이는 서양 승마 뿌리 추출물이 ABTS 및 DPPH 라디칼과 모두 효과적으로 반응하여 높은 항산화 활성을 나타냄을 의미한다. 이러한 연구 결과는 서양 승마 뿌리 추출물의 화합물이 화학적 특성의 차이에 따라 ABTS 및 DPPH 라디칼과 다르게 반응할 수 있음을 시사한다. ABTS 라디칼은 수용성 항산화 화합물과 민감하게 반응할 가능성이 높으며, 특히 디하이드로칼콘(dihydrochalcone)과 플라바논(flavanones)과 같은 화합물이 항산화 활성에 기여하는 주요 성분일 수 있다. 이에 따라 ABTS 분석에서 높은 항산화 활성을 나타낸다는 기존 연구 결과와 일치한다(Lee et al., 2005). 반면, DPPH 라디칼도 유기 용매 환경에서 높은 소거능을 보였으며, 이는 추출물 내 특정 페놀성 화합물이 효과적인 항산화 작용을 할 가능성을 시사한다(Christodouleas et al., 2015; Martysiak-Źurowska & Wenta, 2012). 이러한 결과는 추출물이 친수성과 소수성 환경 모두에서 효과적으로 작용할 수 있음을 의미하며, 항산화 활성을 평가할 때 다양한 분석 방법을 적용하는 것이 중요함을 강조한다. 또한, 서양 승마 뿌리 추출물의 높은 ABTS 및 DPPH 소거능은 생물학적 시스템에서 활성 산소를 효과적으로 제거할 가능성이 크다는 것을 시사한다. 기존 연구에서도 친수성 항산화 물질은 ABTS 분석법에서 더욱 민감하게 반응하는 경향을 보였으며(Floegel et al., 2011), 본 연구에서도 유사한 경향이 관찰되었다. 다만, DPPH 분석에서도 상당한 항산화 활성이 나타난 점을 고려하면, 추출물이 다양한 환경에서 항산화 작용을 할 가능성이 높으며, 특정 환경에서의 반응성 차이를 추가적으로 연구할 필요가 있다.

2. 서양 승마 뿌리 추출물의 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량 평가

서양 승마 뿌리 추출물의 항산화 물질 함량은 총 폴리페놀 함량(total polyphenol content, TPC)과 총 플라보노이드 함량(total flavonoid content, TFC)으로 분석하였다. 서양 승마 뿌리 추출물의 총 폴리페놀 함량과 총 플라보노이드 함량은 각각 92±31 mg/g extract (12.0±4.0 mg/g root)와 3.5±0.3 mg/g extract (0.5±0.5 mg/g root)이었다(Table 1). 서양 승마 뿌리 추출물의 총 폴리페놀 함량은 국내산 승마 추출물의 63.7±3.0 mg/g extract보다 약 50% 많이 함유된 것으로 보고되었다(Lee et al., 2011).

서양 승마 뿌리 추출물은 식물생리활성 물질 중 총 폴리페놀 함량의 일부인 총 플라보노이드 함량이 총 폴리페놀 함량의 약 3.9%으로 폴리페놀 함량에 대한 기여도가 미미하다. 이는 추출물에서 페놀산 및 탄닌과 같은 비플라보노이드 계열의 폴리페놀 화합물이 상대적으로 높은 농도로 존재하여 총 폴리페놀 함량의 상당 부분을 차지하는 것으로 추정되었다(Karafyllaki et al., 2023; Tomsone et al., 2012). 추출물에 높은 폴리페놀 함량과 낮은 플라보노이드 함량의 존재는 항산화 활성 및 항균 특성을 나타내며, 전반적인 건강, 특히 부비동염 및 여성질환 감염 등에 영향을 미친 것으로 나타났다(Hwang & Lee, 2010). 폴리페놀은 강력한 항산화 특성이 있으며, 높은 폴리페놀 함량과 총 페놀류의 증가가 항산화 활성의 향상과 상관관계를 나타낸 것으로 보고되었다(Nieto et al., 2023). 반면에, 플라보노이드 농도가 낮을 경우, 추출물의 특정 활성 산소 제거 능력이 제한되어 산화 스트레스에 대한 전반적인 효능이 잠재적으로 감소한 것으로 보고되었다(Vyas & Braganza, 2019). 이러한 결과는 추출 방법에 따라 결정될 수 있다. 추출 방법은 폴리페놀과 플라보노이드 수율에 직접적인 영향을 미치며, 예를 들어 하이드로알코올 추출법은 이러한 화합물의 회수를 최적화하여 항산화 활성을 증진시키는 것으로 알려져 있다(Kamiński et al., 2022; Safari et al., 2023). 일반적으로 폴리페놀 함량이 높은 것이 항산화 효과 면에서 유리하지만, 플라보노이드 함량이 상대적으로 낮을 경우 건강상의 이점을 극대화하기 위해 적절한 추출 방법과 다른 생리활성 화합물과의 상호작용을 고려해야 한다는 것을 의미한다.

3. 서양 승마 뿌리 추출물의 항균 효능

서양 승마 뿌리 추출물의 항균 효과는 황색포도상구균(S. aureus)를 대상으로 평가하였고, aminoglycoside 계열 항생제인 gentamicin 을 비교군으로 하였다(Figure 2). 황색포도상구균은 8시간내에 흡광도 1.5까지 성장하였고, 대조군으로 aminoglycoside 계열 항생제인 1,000 μg/mL의 gentamicin을 투입한 경우 흡광도 0.8로 성장이 저 해 받았다(Figure 2). 뿌리 추출물 250-2,000 μg/mL의 농도에서는 추출물의 농도가 증가함에 따라 황색포도상구균의 성장이 저해 받았다(Figure 2). 8 h 경과 후 황색포도상구균의 흡광도는 추출물이 없는 조건에서 1.5까지 증가하였다. 뿌리추출물은 농도의존적으로 항균효과를 나타내며 2,000 μg/mL 농도에서는 흡광도가 0.7까지 감소하였다. 1,000 μg/mL gentamicin의 S. aureus 에 대한 생장 저해율은 약 42.4% 이었다(Figure 3). 서양 승마 뿌리 추출물은 농도가 증가함에 따라 선형적으로 생장 저해율이 증가하였으며, 250 μg/mL의 농도에서 약 19.5%를 억제하였고 2,000 μg/mL에서는 약 56.9% 억제하였다. 뿌리 추출물은 비교군인 gentamicin과 같은 농도인 1,000 μg/mL에서 43.5%로 저해율이 유사하였다. 이러한 결과는 서양 승마 뿌리 추출물은 정제되지 않은 crude extract임에도 불구하고 gentamicin과 유사한 항균 활성을 보일 수 있음을 의미한다. 또한, 본 연구결과와 더불어 서양 승마 추출물이 100 μg/mL 농도에서 Helicobacter pylori 군집 형성을 완전히 억제한 연구(Kim et al., 2011b)는 서양 승마가 강력한 항균 활성을 지닌 자연 유래 물질임을 보여준다. 이러한 연구들은 서양 승마 뿌리 추출물이 효과적인 천연 항균제 중 하나로 활용될 가능성을 뒷받침한다.

4. 서양 승마 뿌리 추출물의 세포 독성 평가

서양 승마 뿌리 추출물의 세포 독성은 RAW 264.7 세포를 이용한 MTT assay 분석결과를 Figure 4에 도시하였다. 서양 승마 뿌리 추출물은 시험 농도범위내에서 RAW 264.7 세포에 대한 세포 독성이 없음을 확인하였다. 이는 서양 승마의 주요 성분인 cycloartane triterpenes가 인간 암 세포주에 대해 상대적으로 낮은 독성을 보이며, 서양 승마가 포유류 세포에 대해 일반적으로 안전하다는 기존 연구와 일치한다(Jo et al., 2024). 또한, 관련 식물인 황새승마(Cimicifuga foetida)의 뿌리에서 추출된 cycloartane triterpenoid saponins는 IC₅₀ 값이 4.02-15.80 μM 범위에서 세포 독성을 나타낸 바 있다. 일부 cycloartane triterpenes 관련 화합물은 높은 농도에서 세포 독성이 보고되었으나, 서양 승마에 포함된 성분은 세포 독성의 가능성이 낮음을 시사한다(Lu et al., 2019). 이러한 연구 결과는 서양 승마 뿌리 추출물과 그 주요 성분인 cycloartane triterpenes가 포유류 세포에 유해한 영향을 미치지 않을 가능성이 높음을 보여준다.

5. 서양 승마 뿌리 추출물의 TNF-α와 산화질소의 발현 억제 평가

서양 승마 뿌리 추출물의 항염 효능은 RAW 264.7 세포에서 유도한 TNF-α 발현을 억제하는 능력으로 평가하였다(Figure 5). RAW 264.7 세포는 24 h 배양시 염증성 사이토카인인 TNF-α가 약 0.0±0.0 ng/mL 생성되었고, 1 μg/mL 농도의 지질다당류(lipopolysaccharide, LPS)로 처리하였을 때 TNF-α 생성이 약 1.8±0.1 ng/mL 유도되었다. LPS로 자극된 RAW 264.7 세포에 코르티코스테로이드(corticosteroid)인 dexamethasone (DEX)을 20 μg/mL 처리하였을 때 생성된 TNF-α는 약 0.4±0.0 ng/mL로 TNF-α 발현이 약 78.4% 감소하였다. 서양 승마 뿌리 추출물은 첨가 농도가 증가함에 따라 TNF-α 발현이 감소하였다. TNF-α 발현은 추출물의 투입농도가 10 μg/mL와 100 μg/mL일 때 각각 1.4±0.1 ng/mL와 0.8±0.2 ng/mL으로 TNF-α 발현 억제 효율은 각각 21.2%와 55.3% 이었다. 서양 승마 뿌리의 염증 억제 효능에 대한 연구 결과는 선행 연구에서도 확인이 가능하다. 노루삼속 Actaea 종에서 발견된 후키놀 산(fukinolic acid)과 시미시푸직 산(cimicifugic acid)과 같은 화합물은 염증 반응에 관여하는 중성구 엘라스타제(neutrophil elastase)를 억제하여 항염 활성을 보이는 것으로 밝혀졌다(Jahn & Petersen, 2022). 서양 승마의 수성 추출물은 히알루로니다제(hyaluronidase) 활성을 억제하여 항염증 효과를 나타냈으며(Kim et al., 1994), 서양 승마 뿌리가 포함된 승마 갈근탕은 항염 활성을 나타내며 IL-4 및 IL-13과 같은 염증성 사이토카인 발현을 감소시키는 것으로 보고되었다(Thi Huong Nguyen et al., 2022). 이러한 연구 결과들을 포함하여 본 연구 결과는 서양 승마 뿌리 추출물이 정제된 순수물질인 DEX와 달리 정제되지 않은 crude extract임을 감안할 때 서양 승마 뿌리 추출물이 염증 발현 억제효과가 양호함을 의미한다.

서양 승마 뿌리 추출물의 RAW 264.7 세포에 대한 산화질소(NO) 생성 억제 활성을 Figure 6에 도시하였다. RAW 264.7 세포는 24 h 배양시 NO가 약 1.5±0.0 μM이 생성되었고, 1 μg/mL 농도의 LPS로 처리하였을 때 NO가 약 4.1±0.1 μM이 생성되어 LPS 자극에 의해 NO 유발이 약 2.7배 증가하였다. 1 μg/mL의 LPS와 20 μg/mL의 DEX로 처리하였을 때 생성된 NO는 약 2.1±0.0 μM로 NO 발현이 약 50% 감소하였다. 서양 승마 뿌리 추출물은 미량(1 μg/mL) 첨가만으로도 NO 생성이 억제되었고, 투입농도가 지수함수로 증가함에 따라 NO생성이 선형적으로 감소하였다. 추출물의 농도가 100 μg/mL 일 때 NO 발현은 약 1.8±0.1 ng/mL으로 LPS를 주입하지 않은 대조군과 거의 유사하다. 이러한 결과는 서양 승마 뿌리 추출물이 LPS에 의한 세포 자극을 효과적으로 억제할 수 있음을 시사한다. 또한, 산화질소(NO)는 인체에서 중요한 신호전달 분자로 작용하지만, 과도하게 생성될 경우 산화 스트레스, 염증, 그리고 패혈증과 같은 질환에서 조직 손상을 유발할 수 있다(Nian et al., 2012; Shi et al., 2019). 등수국 잎에서 분리된 n-Hex 및 EtOAc 화합물이 100 μM 이하의 농도에서 산화질소 발현을 45% 억제하는 연구결과(Ashawat et al., 2009)와 비교할 때, 서양 승마 뿌리 추출물은 산화질소 생성을 보다 효과적으로 억제할 수 있는 천연물질 중 하나로 판단된다.

6. 서양 승마 뿌리 추출물의 주름 개선 효능(elastase 활성 억제)평가

서양 승마 뿌리 추출물의 elastase 활성억제 효과를 Figure 7에 도시하였다. Elastase 활성억제에 대해 양성 대조군인 ursolic acid은 농도가 증가함에 따라 elastase 활성억제 효과가 증가하였고, 0.25 μg/mL 농도에서 약 76.9% 억제되었다(Figure 7A). 서양 승마 뿌리 추출물은 100 μg/mL까지는 지수적으로 농도가 증가함에 따라 elastase 활성억제율이 거의 선형적으로 증가하였고, 1,000 μg/mL 농도에서는 활성억제율이 약 43.0%이었다(Figure 7B). 서양 승마 뿌리 추출물이 대조군인 ursolic acid에 비해 상대적으로 억제 효과가 낮지만 천연 유래 물질임에도 불구하고 elastase에 대해 유의미한 억제 효과를 보이고 있다. Elastase 활성억제 효과가 있는 다양한 식물 추출물이 연구되어 왔다. 우엉뿌리(50.9%), 방광풀(50.2%), 당귀(31.6%)를 포함한 21종의 식물 추출물 중 9 종에서 elastase 활성억제 효능이 확인되었으며(Thring et al., 2009), 염생 식물 22 종중 Actaea heracleifolia 추출물은 74.5±0.2%, Staphylococcus aureus 추출물은 74.9±4.8%로 높은 elastase 저해 효과를 보였다(Jiratchayamaethasakul et al., 2020). 괭생이모자반 추출물 또한 1,000 μg/mL 농도에서 elastase 활성을 약 42.7±6.2% 억제하는 것으로 보고되었다(Choi et al., 2004). Elastase 활성 억제 효과가 뛰어난 천연 추출물은 일반적으로 약 40% 내외의 억제율을 보이며, 이는 본 연구 결과와 유사한 경향을 나타낸다.

7. 서양 승마 뿌리 추출물에 의한 hMMP-1 저해 활성 평가

광노화 및 피부 손상에 중요한 역할을 하는 콜라겐 분해효소인 matrix metalloproteinases-1 (hMMP-1)에 대한 서양 승마 뿌리 추출물의 저해 활성을 Figure 8에 도시하였다. HDFs 세포는 무자극 상태일 때 hMMP-1이 약 0.6±0.1 ng/mL 생성되었지만 UVB 조사에 의해 약 3.1±0.2 ng/mL으로 약 4.9배 증가하였다. Retinol 처리 시 hMMP-1 발현이 약 83% 감소(0.5±0.0 ng/mL)되었다. 서양 승마 뿌리 추출물은 HDFs 세포의 hMMP-1 발현을 효과적으로 저감하였다. 추출물의 농도가 0.01에서 10 μg/mL까지 지수적으로 증가함에 따라 hMMP-1발현이 거의 선형적으로 감소하였다. hMMP-1 발현은 추출물 농도 0.01 μg/mL 농도에서 약 2.7% 감소한 3.0±0.3 ng/mL이었고, 10 μg/mL 농도에서 약 35.3% 감소한 2.0±0.1 ng mL이었다. 100 μg/mL의 추출물은 hMMP-1발현을 약 89.1% 억제(0.3±0.0 ng/mL)하였다. hMMP-1 발현을 억제하는 천연물질로는 black rice 추출물이 100 μg/mL 농도에서 hMMP-1 발현을 24% 감소시킨 것으로 보고되었으며(Bittner et al., 2016), Quercus glauca (참나무과)에서 유래한 상록수 Thunberg (QG) 추출물은 11.4%의 억제 효과를 나타낸 것으로 확인되었다(Lee et al., 2010). 서양 승마 뿌리 추출물은 black rice 및 Quercus glauca 추출물과 비교했을 때, hMMP-1 저해 활성이 더욱 우수한 것으로 나타났다. hMMP-1은 피부의 세포외 기질(ECM)에서 콜라겐 분해를 촉진하여 주름, 피부 처짐, 탄력 저하 등의 노화를 유발하는 주요 효소로 알려져 있다(Li et al., 2024). Retinol은 콜라겐과 젤라틴을 분해하는 hMMP-1의 생성 메커니즘을 억제함으로써 광노화로 인한 피부 변화 개선에 기여하는 것으로 보고되었다(Lee & Bae, 2011). 서양 승마 뿌리 추출물은 대조군으로 사용된 retinol보다도 hMMP-1 저해 활성이 다소 뛰어나며, 이러한 결과는 서양 승마 뿌리 추출물이 피부 노화 억제 및 탄력 유지에 효과적인 천연 소재로 활용될 가능성을 보여준다.

Conclusion

기능성 천연물질로 서양 승마 뿌리 추출물의 활용 가능성을 규명하기 위하여 항산화능, 총 폴리페놀 함량과 총 플라보노이드 함량, 항균효과, 세포독성, 산화질소 생성 억제활성, elastase 활성억제활성, hMMP-1 저해활성 등을 연구한 주요 결과는 다음과 같다. 서양 승마 뿌리 추출물의 ABTS 및 DPPH 라디칼 소거능은 5,000 μg/mL 농도에서 각각 99.6%와 94.2% 이었고, 총 폴리페놀 함량과 총 플라보노이드 함량은 각각 92±31 mg/g extract와 3.5±0.3 mg/g extract이었다. 뿌리 추출물은 황색포도상구균(S. aureus)의 생장을 효과적으로 저해하였다. 추출물에 의한 생장 저해율은 추출물의 농도가 증가함에 따라 선형적으로 증가하였으며, 1,000 μg/mL에서 비교군인 gentamicin과 유사한 43.5%로 항균효과가 우수하였다. 뿌리 추출물은 RAW 264.7 세포를 이용한 MTT assay 분석을 통해 세포 독성이 관찰되지 않았다. 또한, 뿌리 추출물의 RAW 264.7 세포에 대한 산화질소(NO) 생성 억제활성은 뿌리 추출물의 농도가 증가함에 따라 TNF-α 발현이 감소하였다. 추출물의 농도가 10 μg/mL와 100 μg/mL일 때 TNF-α 발현 억제 효율은 각각 21.2%와 55.3% 이었다. 뿌리 추출물은 RAW 264.7 세포의 LPS 자극에 의한 NO 생성을 미량(1 μg/mL) 첨가만으로도 억제가 가능하였다. 추출물의 농도가 지수함수로 증가함에 따라 NO 생성이 선형적으로 감소하였고, 100 μg/mL일 때 NO 발현은 약 1.8±0.1 ng/mL으로 LPS를 주입하지 않은 대조군과 거의 유사할 정도로 LPS 자극을 효과적으로 차단하였다. 뿌리 추출물의 elastase 활성억제율은 농도가 지수적으로 증가함에 따라 elastase 활성억제율이 증가하였으며, 1,000 μg/mL 농도에서는 elastase 활성억제 효능이 우수한 천연추출물들과 유사한 43.0% 수준이었다. 뿌리 추출물은 HDFs 세포의 hMMP-1 발현의 저감효과가 우수하였다. 추출물의 농도가 증가함에 따라 MMP-1 발현이 거의 선형적으로 감소하였고, 100 μg/mL에서 hMMP-1 발현을 약 89.1% 억제(0.3±0.0 ng/mL)하였다. 뿌리 추출물은 대조군인 retinol보다도 hMMP-1 저해활성이 다소 우수하였다. 이러한 연구 결과는 서양 승마 뿌리 추출물이 항산화능, 총 폴리페놀 함량과 총 플라보노이드 함량, 항균효과, 세포독성, 산화질소 생성 억제활성, elastase 활성억제활성, hMMP-1 저해활성 등이 우수한 기능성 천연소재 중 하나임을 의미한다.

NOTES

Author's contribution

Y.J.K. conducted experiments, analyzed data, and contributed to the preparation of the manuscript. H.W.R. supervised the study, guided the overall research direction, and reviewed the manuscript. T.E.K. organized and processed the experimental data. C.H.H. and K.H.K. assisted in conducting the experiments, verified the accuracy of the obtained results, and contributed to data interpretation. All authors reviewed and approved the final manuscript.

Author details

Yeo Jin Kim (Graduate Student)/Tae Eun Kim /Chae Hyun Han (Graduate Student)/Kwang Hee Kim (Graduate Student), Hee Wook Ryu (Professor), Department of Chemical Engineering, Soongsil University, 369, Sangdo-ro, Dongjak-gu, Seoul 06978, Korea.

Figure 1.

Radical scavenging efficiency of A. heracleifolia root extract.

The radical scavenging efficiency of the A. heraclitica root extract at concentrations of 0, 625, 1,250, 2,500, 5,000, and 10,000 μg/mL was measured for ABTS and DPPH radicals. (A) ABTS and (B) DPPH radicals at different concentrations. Statistical analysis was performed in comparison to the control group (^**p<0.01, ^***p<0.001).

Figure 2.

Antimicrobial activity assessment of A. heracleifolia root extract.

(A) A series of test tubes were prepared, and an equal volume of medium inoculated with S. aureus (ATCC25923) at a concentration of 1×10⁷ CFU/mL were distributed. at 1,000 μg/mL of gentamicin was used as a positive control, and A. heraclitica root extract was added at a concentration of 250-2,000 μg/mL, incubated for 8 h, and OD was measured at 600 nm at 2 h intervals.

Figure 3.

Inhibitory effects of A. heracleifolia root extract on Staphylococcus aureus.

The inhibitory effects of A. heracleifolia root extract at concentrations of 250, 500, 1,000, and 2,000 μg/mL on S. aureus were compared after 8 h of exposure. Statistical tests for each experimental group were performed compared to gentamicin at 1,000 μg/mL (^*p<0.05, ^**p<0.01, ^***p<0.001).

Figure 4.

Cytotoxicity of A. heracleifolia root extract.

The cytotoxic effects of A. heracleifolia root extract at concentrations of 1, 10, and 100 μg/mL were evaluated after treating RAW 264.7 cells for 24 h.

Figure 5.

Suppressive effects of A. heracleifolia root extract on TNF-α expression.

To evaluate the anti-inflammatory activity of the A. heracleifolia root extract, RAW 264.7 cells were treated with the pro-inflammatory agent LPS at 1 μg/mL. Subsequently, the cells were treated with dexamethasone (DEX) at 20 μg/mL and A. heracleifolia root extract (EXT) at concentrations of 1, 10, and 100 μg/mL. After 24 h of treatment, the extent to which inflammation was suppressed was assessed. Statistical analysis was performed by comparing each experimental group with the DEX group (^**p<0.01, ^***p<0.001).

Figure 6.

Evaluation of the inhibition of NO production by A. heracleifolia root extract.

The inhibitory effect of A. heracleifolia root extract on NO production was assessed in RAW 264.7 cells. The NO content was quantified in micromoles using sodium nitrite as a standard. Statistical tests for each experimental group were performed compared with dexamethasone (DEX) as a control (^*p<0.05, ^**p<0.01).

Figure 7.

Evaluation of elastase inhibition by the root extract of A. heracleifolia.

The inhibitory effect of A. heracleifolia root extract on elastase was analyzed in HDF cells. Elastase inhibition was evaluated using (A) ursolic acid as the positive control and (B) A. heracleifolia root extract at concentrations of 1, 10, 100, and 1,000 μg/mL.

Figure 8.

Evaluation of hMMP-1 inhibition by A. heracleifolia root extract.

The inhibitory effect of A. heracleifolia root extract on hMMP-1 expression was assessed in HDF cells exposed to UVB radiation at 20 mJ/cm². The cells were subsequently treated with retinol (20 μM) as a positive control and A. heracleifolia root extract (EXT) at concentrations of 0.01, 0.1, 1, 10, and 100 μg/mL. Statistical tests were performed in comparison to the retinol-treated group (^***p<0.001).

Table 1.

Total content of polyphenols and flavonoids in A. heracleifolia

	Total polyphenol content (mg/g extract)	Total flavonoid content (mg/g extract)
A. heracleifolia	92±31	3.5±0.3

*The total polyphenol content of A. heracleifolia was 92 mg per gram of extract, and the total flavonoid content was 3.5 mg per gram of extract.

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