몰로키아(Corchorus olitorius L.)와 그라비올라(Annona muricata L.) 추출물의 항균, 항산화 및 멜라닌 합성 저해 활성 비교 분석
요약
목적
본 연구는 몰로키아와 그라비올라 추출물의 항균과 항산화, 멜라닌 합성 저해 활성을 비교하여 살펴보았다.
방법
몰로키아와 그라비올라 1차 추출물은 85% 에탄올로 얻었고 이를 클로로포름층(CL)과 에틸아세테이트층(EL), 증류수층(WL)으로 분리하였다. 항균 활성은 그람양성균(Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis)과 그람음성균(Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli)을 각 2종씩 선정하여 액체배지에서 진행하였다. 세포 생존율은 HaCaT cell과 B16F10 cell에 추출물 10 μg/mL, 20 μg/mL, 40 μg/mL의 농도로 처리하여 관찰하였다. 항산화 활성은 DCFDA assay로 조사하였고 멜라닌 합성 저해 활성은 α-MSH를 처리하여 진행하였다.
결과
몰로키아 CL과 EL, 그라비올라 CL에서 관찰 24 h 동안 항균 활성이 나타났고 그 중에서 몰로키아 EL은 황색포도상구균과 표피포도상구균, 녹농균에 대해 효과가 관찰되었다. 두 시료의 추출물들은 HaCaT cell과 B16F10 cell에 대해 대체로 영향을 주지 않았지만 그라비올라 CL 40 μg/mL에서는 생존율이 감소하였다. 몰로키아와 그라비올라의 산화 억제 효과는 모두 우수하였는데 그라비올라 EL 20 μg/mL와 40 μg/mL는 glutathione과 유사하거나 좀더 우수하였다. 멜라닌의 합성을 저해하는 효과는 몰로키아 EL 20 μg/mL와 40 μg/mL에서 확인하였다.
결론
연구를 통해 몰로키아와 그라비올라는 항균과 항산화 능력을 가지고 있고 몰로키아는 멜라닌 합성을 저해할 수 있다는 것을 알 수 있었다. 이로써 몰로키아와 그라비올라는 식품이나 화장품의 품질 유지와 미백 기능성 원료로 활용할 수 있다고 판단된다.
핵심용어: 몰로키아, 그라비올라, 항균, 항산화, 멜라닌 합성 저해
Abstract
Purpose
This study aimed to compare the antibacterial, antioxidant, and melanin synthesis inhibitory activities of Corchorus olitorius L. (molokhia) and Annona muricata L. (graviola) extracts.
Methods
Primary extracts of molokhia and graviola were prepared using 85% ethanol and separated into the following three layers: the chloroform layer (CL), the ethyl acetate layer (EL), and the distilled water layer (WL). Antibacterial activity was determined in a liquid medium using two types of gram-positive bacteria (Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis) and two types of gram-negative bacteria (Pseudomonas aeruginosa and Escherichia coli). Cell viability was measured by treating HaCaT and B16F10 cells with 10, 20, and 40 μg/mL of each extract. Antioxidant activity was measured using the 2’,7’– dichlorofluorescin diacetate (DCFDA) assay, and melanin synthesis inhibitory activity was analyzed following the α-melanocyte-stimulating hormone treatment.
Results
Antibacterial activity was observed in the molokhia CL and EL, as well as in the graviola CL, for up to 24 hours. Among the three different layers of the extracts, the molokhia EL exhibited significant antibacterial effects against S. aureus, S. epidermidis, and P. aeruginosa. The extracts showed no significant effect on the viability of HaCaT and B16F10 cells; however, a decrease in the survival rate was observed at 40 μg/mL of the Graviola CL. Both molokhia and graviola exhibited strong antioxidant effects, with the graviola EL (20 and 40 μg/mL) demonstrating notable activity comparable to that of glutathione. In addition, the molokhia EL exhibited significant melanin synthesis inhibitory effects at 20 and 40 μg/mL.
Conclusion
Molokhia and graviola possess antibacterial and antioxidant properties, while molokhia also inhibits melanin synthesis. These findings suggest that molokhia and graviola might be used as functional ingredients for maintaining food and cosmetic quality, as well as for skin-whitening applications.
Keywords: Molokhia, Graviloa, Antibacterial, Antioxidant, Inhibition of melanin synthesis
中文摘要
目的
本研究旨在比较黄麻(Corchorus olitorius L.，Molokhia)和刺果番荔枝(Annona muricata L.，Graviola) 提取物的抗菌、抗氧化和黑色素合成抑制活性。
方法
用85%乙醇制备Molokhia和Graviola的初级提取物，并将其分为以下三层：氯仿层(CL)、乙酸乙酯层(EL)和蒸馏水层(WL)。在液体培养基中使用两种革兰氏阳性菌(金黄 色葡萄球菌和表皮葡萄球菌)和两种革兰氏阴性菌(铜绿假单胞菌和大肠杆菌)测定抗菌活性。通过用10、20和40 μg/mL各提取物处理HaCaT和B16F10细胞来测量细胞活力。使用2',7'-二氯荧光素二乙酸酯(DCFDA)分析法测量抗氧化活性，并在α-促黑素细胞激素处理后分析黑色素合成抑制活性。
结果
在Molokhia CL和EL以及Graviola CL中均观察到长达24小时的抗菌活性。在三种不同层提取物中，Molokhia EL对金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和铜绿假单胞菌表现出显著的抗菌作用。提取物对HaCaT和B16F10细胞活力无显著影响；然而，Graviola CL 浓度在40 μg/mL时，细胞存活率有所下降。Molokhia和Graviola均表现出强大的抗氧化作用，其中Graviola EL(20和40 μg/mL)表现出与谷胱甘肽相当的显著活性。此外，Molokhia EL在20和40 μg/mL 浓度下，表现出显著的黑色素合成抑制作用。
结论
Molokhia和Graviola具有抗菌和抗氧化特性，Graviola还能抑制黑色素合成。 这些发现表明，Molokhia和Graviola可作为功能性成分，用于维持食品和化妆品的品质，并可用于美白肌肤。
关键词: Molokhia, Graviloa, 抗菌, 抗氧化, 抑制黑色素合成
Introduction
예로부터 우리나라와 중국에서는 약식동원(藥食同源)의 개념이 있었는데 이는 약과 음식의 그 근원이 같다는 뜻이다. 서양에서도 히포크라테스가 식품이 약이 되고 약이 식품이 된다고 하였고 300-400개 정도의 식물을 치료 용도로 사용하였다고 한다( Soe et al., 2023). 전통적으로 전해오는 민간약의 효능을 바탕으로 생리활성 물질을 분리하여 의약품을 개발하는 것은 적지 않은 성공을 얻고 있다. 그러나 민간 전승약으로 이용되어 온 식물에 대해 제약회사나 대학연구기관에서 다양한 검색 시스템을 이용하여 꼼꼼하게 검색하였음에도 불구하고 식물계의 약 10% 정도에서 몇몇의 생리활성물질만이 규명된 것으로 밝혀졌다( Natural Product Chemistry Textbook Compilation Committee, 2003). 식물의 생리활성물질은 식물 자체의 기능을 조절, 수행하기 위한 성분 외에도 곤충이나 미생물로부터 자신을 보호하는 성분도 있다( Soe et al., 2023). 전자를 1차 대사산물이라고 하고 후자를 2차 대사산물이라고 하는데 2차 대사산물은 의약품 개발 연구대상이다( Natural Product Chemistry Textbook Compilation Committee, 2003). 또한, 2차 대사산물인 페놀성 화합물과 테르페노이드 화합물은 미백, 주름개선, 피부노화 방지의 다양한 효능을 나타낸다( Heo et al., 2005; Kim et al., 2025a). 이에 자연유래 기능성 화장품 소재에 대한 연구가 꾸준히 진행되고 있다( Han & Yi, 2012; Yi & Bu, 2017; Kim & Park, 2019; Im & Sung, 2021; Yoo et al., 2023). 또한, 화장품 뿐만 아니라 식품에서 중요한 품질유지원료인 항산화제와 항균제에 대한 연구도 지속적으로 연구되고 있고 있다( Eum, 2012; Choi et al., 2015; Lee et al., 2016; Kim et al., 2018; Jeong & Yang, 2023; Kim et al., 2025b). 몰로키아( Corchorus olitorius L.)는 열대 아프리카와 여러 나라에서 토종 잎채소로 널리 사용되고 있는데 단백질, 지질, 섬유질, 비타민 C를 포함한 영양소와 생체 활성 화합물을 함유하고 있어 사람의 영양 섭취에 기여할 가능성으로 더욱 주목받고 있다( Atli et al., 2024; Pholoma et al., 2024). 그 외에도 페놀류, 다당류, 카로티노이드, 미네랄, 당, 및 비타민 B1, B2, E를 함유하고 있다( Helaly et al., 2017). 특히, 이집트에서는 식용 식물과 약용 식물로 많이 소비되고 있으며 그 잎은 통증, 발열 및 염증에 대해 민간약으로 방광염, 배뇨 장애, 발열 및 임질 등에 사용되고 있다( Zeghichi et al., 2003; Lee et al., 2020). 몰로키아에 함유된 페놀, 플라보노이드, 알칼로이드 등은 항산화 및 간 손상 보호( Al-Khalifah & Ahmed, 2021), 면역 조절 활성( Park et al., 2018), 장내 세균 불균형과 비만의 개선( Lee et al., 2020), 항산화와 항균( Yakoub et al., 2018), 항염( Yoo & Lee, 2021), 항당뇨 활성( Ahmed, 2021), 식품의 품질 유지 및 특성 개선( Jeong et al., 2023), 항아토피 피부염( Lee et al., 2024) 등에 효과가 있다고 보고되고 있다. 그라비올라( Annona muricata L.)는 열대 국가들에 널리 퍼져 있으며 식물의 각 부위들이 우수한 약리적 특성을 가지고 있다. 이 식물은 플라보노이드, 알칼로이드, 아세토게닌, 페놀 및 친유성 화합물의 함량이 높아 전통 의학의 기초를 이루고 있다( Gyesi et al., 2019; Balderrama-Carmona et al., 2020). 1981년에서 2021년 사이에 발표된 49편의 그라비올라 논문을 분석해 보면, 항암(25%), 항궤양(17%), 항당뇨병(14%), 항원생동물(10%), 설사(8%), 항균(8%), 항바이러스(8%), 항고혈압(6%), 상처 치유(4%)의 활성이 있다고 한다( Mutakin et al., 2022). 그 외에도 항염( Cho et al., 2017), 항산화( Park et al., 2017), 신경 보호( Keskin et al., 2022; Kim et al., 2020), 기능성 화장품 소재( Shin et al., 2017), 식품 가공 및 보존( Gyesi et al., 2019) 등에 효과가 있음이 보고되고 있다. 몰로키아와 그라비올라는 자생지에서 식용 뿐만 아니라 약용으로도 쓰이고 있어 다양한 연구가 진행하고 있지만 세포주에서의 효과 연구는 부족한 실정이다. 박테리아에 대한 연구도 고체 배지에서 진행하는 연구가 대다수이고 액체 배지에서의 활성 연구는 미비하다.
본 연구에서는 다양한 약리적 활성이 보고되고 있는 몰로키아와 그라비올라 추출물을 극성을 달리하는 용매로 분획하여 용매별 생리 활성 효과를 비교하였다. 세포주인 HaCaT cell과 B16F10 cell을 통해 자연유래의 항산화제와 미백 기능성 화장품 소재로서 가능성을 살펴보고 그람양성균 2종과 그람음성균 2종으로 자연유래 항균제로 활용 여부를 액체 배지를 통해서 관찰한 후 두 시료의 효과를 비교해 보고자 한다.
Methods
1. 시료 및 추출
본 연구의 시료인 몰로키아는 이집트에서 재배되고 건조된 것을 두손애약초(Yeongcheon, Korea)에서 수입하여 소분 포장한 것을 구입하였다. 그라비올라도 베트남에서 생산되고 건조한 것을 두손애약초에서 수입한 후 소분 포장한 것을 구매하였다. 두 시료를 각각 100 g씩 취하여 세절하고 별개의 유리 플라스크에 담은 후 85% 에탄올을 시료 중량의 10배로 더하였다. 유리 플라스크를 호일로 감싸고 빛을 차단한 채로 24 h 동안 상온에서 보관하였다. 이후 내용물을 여과하고 동일 시료에 대해 이 과정을 3회 반복하여 실시하였다. 총 여과물들을 rotary evaporator (Rotavapor ® R-114; BÜCHI Labortechink AG, Switzerland)를 이용하여 농축하여 1차 추출물을 얻었다. 이 추출물에 클로로포름(chloroform)과 증류수(distilled water)를 각 300 mL씩 가한 후 분별 깔때기로 클로로포름층(chloroform layer, CL)과 증류수층(water layer, WL)을 분리하였다. 에틸 아세테이트(ethyl acetate) 300 mL를 증류수층에 첨가하여 분별 깔때기로 에틸 아세테이트층(ethyl acetate layer, EL)과 증류수층(WL)으로 나누었다. 분리된 CL과 EL, WL를 각각 농축하여 3가지 최종 추출물을 얻었다( Figure 1).
2. 시약 및 기기
본 연구는 균주와 세포주를 대상으로 시행되었다. 균주를 이용한 항균 측정에 사용된 시약은 액체 배지의 제조에 사용되었다. 액체 배지는 yeast extract (Duchefa Biochemie, Netherlands), tryptone (BD Biosciences, USA), sodium chloride (NaCl; Sigma-Aldrich, USA)로 제조되었다.
세포주를 이용한 세포 생존율과 항산화, 멜라닌 합성 저해 측정에서는 세포 배양을 위한 시약과 효과 측정을 위한 시약이 사용되었다. 세포 배양을 위해서 사용된 시약은 Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM; HyCloneTM, GE Healthcare Life Sciences, USA), fetal bovine serum (FBS; HyCloneTM, GE Healthcare Life Sciences), antibiotics (AB; HyCloneTM, GE Healthcare Life Sciences), trypsin (WELGENE Inc., Korea), phosphate buffered saline (PBS; HyCloneTM, GE Healthcare Life Sciences)이었다. 세포 생존율 측정은 MTS assay로 진행되었는데 CellTiter 96® AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (Promega, USA)가 사용되었다. 항산화 측정은 2’,7’–dichlorofluorescin diacetate (DCFDA) Cellular Reactive Oxygen Species (ROS) Detection Assay Kit (Abcam, UK)로 진행하였고 양성대조군으로 glutathione (Sigma-Aldrich)이 사용되었다. 멜라닌 합성 저해 측정은 α-MSH (Sigma-Aldrich)와 양성대조군인 arbutin (Sigma-Aldrich)으로 진행되었다. 이외에도 ethanol, dimethyl sulfoxide (DMSO), chloroform, ethyl acetate, hydrogen peroxide (H2O2)는 대정화금(Korea)에서 1급 시약을 구입하였다. 증류수는 초순수제조장치(HUMAN POWER II+; Human Corporation, Korea)에서 처리된 것을 사용하였다.
연구에 사용된 기기로 세포 배양은 CO2 incubator (MCO-175; SANYO Electric, Japan)가 있고 균주 배양은 shaking incubator (VS-8480SF; Vision Scientific, Korea)가 있다. 측정은 microplate reader (Synergy HT; Bio-Tek® Instruments, USA)가 사용되었다. 그 외에 centrifuge (Union 32R; Hanil Science Industrial Co., Ltd., Korea), shaker (BF-350SK; BioFree, Korea), auto clave (DAE HAN BIO LINK CO., LTD., Korea)가 있다.
3. 균주와 세포 배양
본 연구의 항균 활성 측정은 그람양성균과 그람음성균의 균주를 통해 진행되었다. 그람양성균은 황색포도상구균(S. aureus; KCTC 1927)과 표피포도상구균(S. epidermidis; KCTC 1917)으로 선정하였고 그람음성군은 녹농균(P. aeruginosa; KTCT 2004)과 대장균(E. coli; KCTC 2571)으로 선택하였다. 균주는 생물자원센터(Korean Collection for Type Cultures, Korea)에서 구입하였다. 균주를 배양하고 활성 측정을 위해 Luria-Bertani (LB; DW: yeast extract : tryptone : sodium chloride=950 : 5 : 10 : 10)의 액체 배지를 제조한 후 auto clave에서 멸균 처리한 것을 사용하였다.
항산화와 멜라닌 합성 저해 측정은 각질형성세포(keratinocyte, HaCaT cell)와 흑색종(melanoma cell, B16F10 cell)으로 정하였다. HaCaT cell과 B16F10 cell은 한국세포주은행(Koeran Cell Line Bank, Korea)에서 구입하였다. 세포는 배양과 측정 과정에서 CO2 incubator (37℃, 5% CO2)에 보관하였다. 세포 배양 배지는 DMEM에 대해 10% FBS와 1% antibiotics 비율로 제조하여 사용되었다.
4. 몰로키아와 그라비올라 추출물의 항균력 측정
액체 배지에서 진행되는 항균 활성 측정은 Kim & Park (2019)의 연구와 동일한 방법으로 진행하였다. 시험관에 액체 배지를 5 mL씩 담고 멸균 처리한 후 진행되었다. 멸균 처리된 액체 배지에 균주 4종을 각각 접종하고 18 h 동안 균주를 배양하고 이를 고체 배지에서 다시 배양해서 single strain을 얻었다. 이를 다시 액체 배지에서 18 h 배양하고 이를 대조군과 실험군 액체 배지에 5 μL씩 접종하였다. 실험군에는 몰로키아와 그라비올라 추출물들을 0.1 mg/mL, 0.2 mg/mL, 0.5 mg/mL씩 처리하였다. 시료와 균주를 처리한 0 h 시점에 액체 배지를 96 well plate에 100 μL씩 담아 microplate reader (600 nm)에서 흡광도를 측정하였다. 이후 12 h과 24 h 시점에 동일한 과정으로 흡광도를 측정하였다. 측정값은 시료의 색채값을 제거한 값으로 정하고 대조군에 대한 상대적인 값에 백분율을 처리하여 얻었다.
5. 몰로키아와 그라비올라 추출물의 세포 생존율 측정
몰로키아와 그라비올라 추출물들이 항산화와 멜라닌 합성 저해 측정에 사용되는 세포의 생존에 영향을 미치는지 알아보기 위해 MTS assay를 시행하였다. 세포 생존율 측정은 Kim & Park (2017)의 연구를 참조하여 진행하였다. HaCaT cell과 B16F10 cell을 96 well plate에 각각 1.5×10 4 cells/well로 분주하고 incubator에서 배양하였다. 세포 배양 24 h 후에 몰로키아와 그라비올라 추출물을 well에 10, 20, 40 μg/mL의 농도로 처리하고 incubator에서 배양하였다. 24 h이 지난 후 MTS 시약을 각 well에 20 μL씩 처리한 후 incubator에서 보관하였다. 3 h 후 formazan을 확인하고 microplate reader (495 nm)에서 흡광도를 측정하였다. 생존율은 대조군에 대한 실험군의 상대적인 값을 백분율로 처리하여 얻었다.
6. 몰로키아와 그라비올라 추출물의 항산화 측정
몰로키아와 그라비올라 추출물이 산화를 억제하는 능력이 있는지를 알아보기 위해 HaCaT cell을 이용하여 진행하였다. 항산화 측정은 Kim & Park (2017)의 연구를 참조하였다. HaCaT cell을 96 well plate에 1.5×10 4 cells/well로 분주한 후에 incubator에서 배양하였다. 24 h 후에 PBS로 2회 세척하고 DCFDA 시약을 20 μM 농도로 처리하였다. 45 min 동안 처리한 후 다시 PBS로 2회 세척하였다. 각 well에 500 μM H 2O 2와 추출물을 10, 20, 40 μg/mL의 농도로 처리하였다. 45 min 동안 incubator에서 보관한 후 microplate reader (485/528 nm)에서 흡광도를 측정하였다. 결과는 대조군에 대한 실험군의 상대적인 값을 백분율로 처리하여 얻었다.
7. 몰로키아와 그라비올라 추출물의 멜라닌 합성 저해 측정
몰로키아와 그라비올라 추출물이 피부 색소와 관련 있는 멜라닌 합성을 저해할 수 있는지를 알아보기 위해 melanoma cell인 B16F10 cell을 이용하여 실험을 진행하였다. 멜라닌 합성 저해 측정은 Kim & Park (2019)의 연구 방법과 동일한 방법으로 진행하였다. 6 well plate에 B16F10 cell을 1×10 5 cells/well로 분주한 후 incubator에서 24 h 동안 보관하였다. 대조군 외에 실험군들에 serum free DMEM에 α-MSH (100 nM)를 처리하고 30 min 동안 보관하였다. 각 well의 배지에 시료를 2X로 첨가한 후 48 h 동안 incubator에서 보관하였다. 이후 배지를 제거하고 PBS로 세척한 후 세포를 e-tube에 모아 원심분리(12,000 rpm, 4℃, 3 min)하였다. Tube 내 상층액을 제거하고 세포의 pellet에 RIPA lysis buffer (Tris-Cl (pH 7.5) 50 mM, NaCl 50 mM, NP-40 1%, sodium deoxycholate 0.5%, SDS 0.1%, protease inhibitor cocktail (Roche, Switzerland))를 처리한 후 ice 환경에서 30 min 동안 보관하였다. 이후 원심분리(14,000 rpm, 4℃, 10 min)을 재진행하고 상층액을 제거하였다. Tube 내에 남은 pellet을 60℃ oven에서 건조하였다. Pellet에 20% DMSO와 2N NaOH 200 μL를 처리한 후 60℃ oven에서 pellet을 용해하였다. 96 well에 100 μL씩 담아 microplate reader (405 nm)에서 흡광도를 측정하였다. 결과는 대조군에 대한 실험군의 상대적인 값을 백분율로 처리하여 얻었다.
8. 통계처리
본 연구의 측정값은 3회 반복하여 시행하여 얻었고 결과 도출은 실험 횟수에 대한 평균값(mean)과 표준편차(standard deviation)로 제시하였다. 통계의 유의성에 대한 분석은 Student’s t-test로 검증하였다. 통계적으로 유의미함은 p<0.05 (*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001)로 정하였다.
Results and Discussion
1. 몰로키아와 그라비올라 추출물의 항균 활성
몰로키아와 그라비올라 추출물들이 그람양성균과 그람음성균에 대해 저해 활성이 있는지를 확인하였다( Table 1). 몰로키아와 그라비올라 추출물들은 그람양성균인 S. aureus와 S. epidermidis에 대해서 항균 효과가 있음을 확인할 수 있었다. 추출물 중에서 몰로키아 EL은 그람양성균 모두에 대해 접종 24 h에서 균을 농도의존적으로 저해하였다. 몰로키아 EL 0.5 mg/mL는 12 h과 24 h에 S. aureus에 대해서 대조군(100%) 대비 20.7%와 67.5%의 항균 효과를 보였고 S. epidermidis에 대해서는 52%와 70.5%의 활성이 나타났다. 몰로키아 CL 0.5 mg/mL도 S. aureus에 대해서 12 h과 24 h에 54.1%와 86%의 효과가 관찰되었다. 그라비올라 CL과 EL, WL도 미약하지만 S. aureus를 저해하였다. 몰로키아와 그라비올라 추출물들은 S. aureus에 대해서 항균 활성이 높게 나타났고 EL≥CL≥WL 순서로 효과가 관찰되었다.
그람음성균인 P. aeruginosa와 E. coli에 대한 추출물들의 항균 효과도 몰로키아 EL에서 관찰되었다. 몰로키아 EL은 P. aeroginosa에 대해 농도의존적으로 균을 저지하였는데 EL 0.5 mg/mL는 12 h과 24 h에서 대조군(100%) 대비 73.6%와 79.7%로 균 성장 속도가 느려지는 것을 확인할 수 있었다. 몰로키아 EL 0.5 mg/mL도 E. coli에 대해서 관찰 24 h에 미약하지만 항균활성이 확인되었고 시간 추이에 따라 균의 증식이 느려졌다. 그라비올라 추출물 중에서는 CL 0.5 mg/mL가 P. aeroginosa에 대해 59.4%와 86.6%의 효과를 나타내었다. 몰로키아와 그라비올라 추출물들은 E. coli보다 P. aeroginosa에 대해 좀더 효과가 있었다.
박테리아에 대한 저해 효과는 몰로키아가 그라비올라보다 좀 더 관찰되었고 몰로키아 EL이 실험군들 중에서 S. aureus와 S. epidermidis, P. aerosinosa에 대해 항균 활성이 높았고 E. coli에 대해서는 24 h에 EL 0.5 mg/mL에서 균 억제가 관찰되었다. Kim & Park (2017)의 연구에서도 몰로키아가 S. aureus와 P. aeroginosa에 대해 균의 성장을 저지한다고 보고하였다. 이 연구에서는 몰로키아 추출물을 클로로포름층과 증류수층으로 분리하고 두 추출물이 모두 S. aureus와 P. aeroginosa에 대해 효과가 있다고 하였다. 본 연구는 증류수층을 에틸 아세테이트층과 증류수층으로 나누었고 에틸 아세테이트층에서 효과가 나타나 몰로키아 항균 물질은 에틸 아세테이트에 좀더 용출되는 것으로 생각된다. iLHAN et al. (2007)의 연구에서는 paper disk method에서 극성을 달리하는 용매들로 추출한 몰로키아 추출물(100 μL)들을 S. aureus와 E. coli에 처리하였을 때 용매별 항균 활성이 달랐다고 하였다. 에틸 아세테이트와 물 혼합 추출물은 S. aureus에 대해서는 효과가 우수하였지만 E. coli에 대해서는 활성이 나타나지 않았다고 하였다. 본 연구에서는 몰로키아 추출물을 0.1 mg/mL와 0.2 mg/mL, 0.5 mg/mL로 처리한 액체 배지에서 S. aureus와 E. coli에 대해 효과가 있었다. Nakaziba et al. (2022)의 연구에서도 몰로키아의 메탄올, 다이에틸 에터, 증류수 추출물들(30 mg/mL)에서 항균 효과가 달랐다고 하며 증류수 추출물에서 두 균주에 대해 효과 있다고 보고하였다. 이는 WL가 효과가 없었던 본 연구 결과와 상이하지만 본 연구가 추출물의 농도를 0.5 mg/mL까지 처리했던 점, 시간이 지남에 따라 균의 활성이 더디어지거나 변화가 적은 경향성으로 보아 추출물의 농도를 앞선 농도로 처리하면 항균 활성이 나타날 수 있을 것으로 판단된다. Choi & Ohk (2017)은 98℃에서 추출한 그라비올라 수성 추출물이 S. epidermidis에서 100 mg/mL 이하에서는 항균 활성이 나타나지 않았다고 하였는데 본 연구에서도 보다 낮은 농도로 처리하였고 항균 효과가 나타나지 않았다. 그러나 본 연구의 추출물 농도가 상당히 낮음에도 일부 분획에서 항균 효과가 나타났는데 이는 해당 분획에 항균 활성이 있는 물질이 포함되어 있기에 가능한 것이라고 생각된다. 이로써 몰로키아와 그라비올라의 항균 활성 물질은 에틸 아세테이트와 클로로포름에 잘 용해되는 물질로 파악된다.
2. 몰로키아와 그라비올라 추출물의 세포 생존율
HaCaT cell과 B16F10 cell은 항산화 효과와 멜라닌 합성 저해 효과를 세포 단계에서 관찰하기 위해 사용되었다. 효과 실험에 선행하여 식물의 구성 물질이 두 세포에 영향을 미치는지 알아보았다( Figure 2A, Figure 2B). 몰로키아 CL과 EL, WL은 HaCaT cell의 생존에 영향을 주지 않았다. 그라비올라 추출물에서도 크게 영향을 주지 않았으나 그라비올라 CL 20, 40 μg/mL에서 HaCaT cell에 다소 영향을 주는 것으로 나타났다(* p<0.05, *** p<0.001). Kim & Park (2017)의 연구에서도 몰로키아 클로로포름층과 증류수층이 HaCaT cell의 생존에 영향을 주는 않는다고 하여 본 연구와 유사하였다. Yoo & Lee (2021)의 연구에서도 몰로키아 열수추출물과 에탄올 추출물이 B16F10 cell에 대해 100 μg/mL이하에서 95% 이상의 세포 생존율을 나타낸다고 하여 본 연구의 WL의 결과와 유사하였다. 몰로키아와 그라비올라 EL과 WL은 B16F10 cell의 생존에 영향을 주지 않았지만 그라비올라 CL은 20, 40 μg/mL 농도에서 B16F10 cell에 미약하지만 영향을 주는 것으로 나타났다(*p<0.05).
본 연구와 선행 연구들을 통해 몰로키아와 그라비올라 EL과 WL은 HacT cell과 B16F10 cell의 생존에 영향을 주지 않지만 그라비올라 CL은 농도에 따라 두 세포의 생존에 영향을 줌으로, 그라비올라 CL은 세포 생존에 영향을 줄 수 있는 물질이 함유되어 있는 것으로 사료된다.
3. 몰로키아와 그라비올라 추출물의 항산화 효과
그라비올라와 몰로키아 추출물이 H 2O 2 로 유발된 산화스트레스를 방어하는지를 HaCaT cell를 통해서 살펴보았다( Figure 3). HaCaT cell에 H2O2 500 μM로 처리한 경우, H2O2로 처리하지 않는 control (100%) 대비 산화스트레스가 229.6%로 증가하였다, 이에 반해 그라비올라 CL 10, 20, 40 μg/mL에서는 산화스트레스가 각각 97.0%, 71.8%, 72.5%로 유의하게 감소되었고(*p<0.05, ***p<0.001), 그라비올라 EL 20, 40 μg/mL에서는 각각 96.9%, 80.6%로 유의하게 산화가 억제되었다(*p<0.05, ***p<0.001). 그리고 그라비올라 WL 10, 20, 40 μg/mL에서도 각각 114.4%, 107.0%, 102.4%로 산화스트레스가 농도의존적으로 감소되었다. 그리비올라 CL 10, 20, 40 μg/mL와 그리비올라 EL 20, 40 μg/mL의 산화스트레스 억제효과는 양성대조군인 glutathione (96.4%)과 비교해도 유사하거나 더 우수함을 확인하였다. 그라비올라 CL 40 μg/mL은 산화스트레스가 72.5%로 많이 감소하였으나 세포 생존율에 영향을 주었다.
그라비올라의 항산화 활성에 대한 연구들로, Choi et al. (2020)은 그라비올라 물추출물이 DPPH 라디컬 소거 assay와 FRAP assay를 통해 항산화 효과가 있다고 하였는데 본 연구 결과와 유사하였다. Jo et al. (2017)도 그라비올라가 우수한 전자공여능을 가진 항산화 시료라고 하였는데 본 연구를 통해서도 그라비올라의 항산화 활성이 확인되었다. Lee et al. (2019)도 그라비올라 에틸 아세테이트 분획물이 DPPH 라디컬 소거능과 환원력 활성에서 효과가 있다고 하였는데 본 연구에서도 그라비올라 EL이 산화스트레스를 효과적으로 억제하여 유사하였다. 몰로키아 추출물들은 그라비올라 추출물에 비해 산화스트레스를 제거하는 능력이 다소 낮지만 효과가 있는 것으로 확인되었다. 몰로키아 추출물들은 CL, EL, WL 모두 농도의존적인 항산화 효과가 나타났다. 그 중에서도 몰로키아 CL과 WL 40 μg/mL에서는 H 2O 2 음성대조군(229%) 대비 각각 116.5%, 117.5%로 산화스트레스가 낮아져서 glutathione (96.4%)에 비교해도 의미가 있었다. 몰로키아 WL은 농도의존적으로 산화스트레스가 각각 125.4%, 119.3%, 117.5%로 낮아졌는데 몰로키아 CL과 EL보다 효과가 좀더 우수하게 나타났다. Kim & Park (2017)에서도 몰로키아 추출물이 산화 억제 효과가 있고 glutathione의 효과와 유사하다고 하였는데 본 연구와 일치하였다. Yoo & Lee (2021)는 몰로키아 추출물이 DPPH 전자공여능과 ABTS 라디컬 소거능 측정에서 산화 억제의 효과가 있고 양성대조군인 vit.C와도 비교할 만하다고 하였다. 이를 통해 몰로키아의 CL과 EL, WL의 추출물 모두 산화스트레스 억제 효능이 있는 것으로 확인할 수 있었다.
4. 몰로키아와 그라비올라 추출물의 멜라닌 합성 저해 효과
멜라닌의 합성을 저해하는 효과는 B16F10 cell을 통해 살펴보았다( Figure 4). 몰로키아와 그라비올라 추출물 중에서 멜라닌의 합성을 저해하는 효과는 몰로키아 EL 40 μg/mL에서 높게 나타났다(* p<0.05). 몰로키아 추출물들은 CL 20 μg/mL 외의 추출물들에서 α-MSH군보다 멜라닌 합성이 저해되었고 EL 20 μg/mL과 40 μg/mL은 대조군(100%) 보다 멜라닌 합성이 저지됨을 관찰할 수 있었다. Yoo & Lee (2021)의 연구에서도 70% 에탄올 추출물과 열수 추출물의 50 μg/mL, 100 μg/mL에서 멜라닌 생합성 저해 효과가 나타났다고 하였는데 본 연구도 α-MSH로 처리된 몰로키아 추출물들이 멜라닌 생합성을 억제하여 유사하였다. 그라비올라 추출물은 EL 40 μg/mL와 WL 10, 20, 40 μg/mL에서 미약하지만 멜라닌 합성 저해 효과가 나타났다. 그라비올라 CL 40 μg/mL에서도 멜라닌 합성 저해 활성이 관찰되었지만 세포 생존율의 영향을 받을 수 있을 것으로 생각된다. Jo et al. (2017)은 그라비올라 에탄올 추출물이 농도의존적으로 melanin 생합성 저해 효과가 있다고 하였는데 본 연구에서도 농도가 높아짐에 따라 멜라닌 합성이 억제되는 것을 확인할 수 있었다. Lee et al. (2019)의 연구에서는 그라비올라 헥세인 추출물의 분획물에서 멜라닌 생합성이 촉진되었다고 하였는데 이는 시료를 추출하는 용매에 기인하는 것으로 판단된다. 이를 통해 천연물의 생리활성 연구를 진행할 때 용매 선택의 중요성을 확인하였다.
Conclusion
본 연구에서는 민간 약용 식물로 관심을 받고 있는 몰로키아와 그라비올라의 생리활성을 비교하여 식품과 화장품 등의 품질 유지 원료와 미백 원료로서 가능성을 살펴보았다.
두 시료는 85% 에탄올로 추출하여 1차 추출물을 얻고 극성이 다른 3 가지 용매를 사용하여 활성 성분을 나누었다. 균에 대한 활성은 몰로키아가 그라비올라보다 우수하였고 분획물 중에는 EL이 효과가 있었다. 몰로키아 추출물은 HaCaT cell과 B16F10 cell에 대해 크게 영향을 주지 않았으나 그라비올라 추출물은 CL 40 μg/mL에서 세포에 영향을 줄 수 있었다. 항산화 활성은 그라비올라 추출물이 높았고 멜라닌 합성 저해 효과는 몰로키아에서 우수하게 나타났는데 모두 EL에서 효과가 높았다.
본 연구를 통해서 몰로키아와 그라비올라는 품질 유지 원료와 미백 원료로서 가능성을 확인할 수 있었는데 용매에 따라 시료의 활성이 상이하였다. 식물은 재배 환경과 추출 방식에 따라서 추출물에 함유되는 생리활성물질이 다를 수 있다. 또한, 효과 측정 방법에 따라서도 효과의 여부나 정도가 상이할 수 있다. 본 연구의 결과는 앞서 제시된 연구 조건에서의 결과임을 연구의 제한점으로 둔다.
추후 연구에서는 몰로키아와 그라비올라에 대한 다양한 재배 환경과 추출 및 측정 방법에 따른 효과를 명확히 살펴보고 생리활성의 메커니즘에 대한 규명도 필요하다고 생각된다. 나아가 이 식물들을 이용한 자연유래 항산화제와 항균제, 미백 기능성 화장품으로 개발되기를 제안해 본다.
Figure 1.
Extraction methods for Corchorus olitorius L. and Annona muricata L.
Molokhia and graviola extracts were prepared using 85% ethanol (1 L) for 24 h at room temperature . The extracts were filtered and concentrated to obtain a residue, which was suspended in chloroform and water to separate the chloroform and water layers. Ethyl acetate was then added to the water layer to separate the water and ethyl acetate layers. Molokhia, Corchorus olitorius L.; Graviola, Annona muricata L.; CL, chloroform layer; EL, ethyl acetate layer; WL, distilled water layer.
Figure 2.
Cell viability of the Corchorus olitorius L. and Annona muricata L. extracts.
Cell viability of (A) HaCaT cells and (B) B16F10 cells treated with the molokhia and graviola extracts was measured using MTS assay. Cell viability is expressed as a percentage relative to the untreated controls. The values are presented as the mean±standard deviation of three independent experiments (*p<0.05, ***p<0.001). Molokhia, Corchorus olitorius L.; Graviola, Annona muricata L.; CL, chloroform layer; EL, ethyl acetate layer; WL, distilled water layer; CTR, control; MTS, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium, inner salt.
Figure 3.
Antioxidant activity of the Corchorus olitorius L. and Annona muricata L. extracts in HaCaT cells.
The antioxidant activity of the molokhia and graviola extracts was assessed using the DCFDA assay. The values are presented as the mean±standard deviation of three independent experiments (*p<0.05, ***p<0.001). Molokhia, Corchorus olitorius L.; Graviola, Annona muricata L.; H2O2, hydrogen peroxide; CL, chloroform layer; EL, ethyl acetate layer; WL, distilled water layer DCFDA, 2’,7’–dichlorofluorescin diacetate.
Figure 4.
Inhibitory effect of the Corchorus olitorius L. and Annona muricata L. extracts on melanin synthesis in B16F10 cells.
The effect of the molokhia and graviola extracts on melanin synthesis in B16F10 cells was measured following the treatment with α-MSH. The values are presented as the mean±standard deviation of three independent experiments (*p<0.05, ***p<0.001). Molokhia, Corchorus olitorius L.; Graviola, Annona muricata L.; CL, chloroform layer; EL, ethyl acetate layer; WL, distilled water layer; α-MSH, α-melanocyte-stimulating hormone.
Table 1.
Antibacterial activity of Corchorus olitorius L. and Annona muricata L. extracts.
|
S. aureus
|
S. epidermidis
|
P. aeruginosa
|
E. coli
|
|
Molokhia |
Exp. group |
Conce. (mg/mL) |
Time
|
Time
|
Time
|
Time
|
|
12 h |
24 h |
12 h |
24 h |
12 h |
24 h |
12 h |
24 h |
|
CL |
0.1 |
87.9 |
102.8 |
104.2 |
99.5 |
104.1 |
112.2 |
114.1 |
118.7 |
|
0.2 |
75.1 |
102.8 |
99.1 |
100.5 |
80.4 |
110.8 |
116.7 |
119.4 |
|
0.5 |
54.1 |
86.0 |
87.3 |
97.0 |
58.5 |
101.6 |
116.3 |
117.2 |
|
EL |
0.1 |
74.0 |
97.2 |
104.5 |
85.4 |
79.2 |
96.0 |
112.6 |
111.6 |
|
0.2 |
48.8 |
78.8 |
82.0 |
79.2 |
79.5 |
86.3 |
112.9 |
103.5 |
|
0.5 |
20.7 |
67.5 |
52.0 |
70.5 |
73.6 |
79.7 |
113.6 |
95.5 |
|
WL |
0.1 |
117.1 |
105.2 |
129.6 |
106.2 |
116.7 |
108.5 |
108.5 |
110.3 |
|
0.2 |
126.5 |
109.8 |
122.3 |
107.6 |
120.5 |
106.5 |
110.5 |
108.1 |
|
0.5 |
126.3 |
109.1 |
126.5 |
119.4 |
109.0 |
110.6 |
111.1 |
111.0 |
|
Graviola |
CL |
0.1 |
78.2 |
93.0 |
106.2 |
107.6 |
97.6 |
115.0 |
109.5 |
120.6 |
|
0.2 |
80.9 |
90.7 |
100.1 |
105.8 |
86.4 |
104.1 |
112.6 |
117.9 |
|
0.5 |
82.8 |
86.8 |
116.7 |
100.6 |
59.4 |
86.6 |
129.7 |
131.3 |
|
EL |
0.1 |
97.8 |
96.5 |
112.7 |
102.7 |
120.8 |
121.2 |
117.3 |
119.4 |
|
0.2 |
96.3 |
94.4 |
107.8 |
102.1 |
109.9 |
107.4 |
114.5 |
117.4 |
|
0.5 |
87.5 |
92.5 |
104.2 |
110.2 |
98.6 |
96.3 |
115.4 |
117.8 |
|
WL |
0.1 |
112.4 |
100.9 |
133.4 |
107.6 |
111.2 |
111.0 |
111.4 |
110.3 |
|
0.2 |
111.7 |
101.5 |
138.6 |
112.7 |
110.2 |
110.0 |
112.9 |
109.9 |
|
0.5 |
109.5 |
97.3 |
137.1 |
124.0 |
108.7 |
101.0 |
112.3 |
111.3 |
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