국내에서 생산된 연자방(농업회사법인 주식회사 두손애약초, Korea)과 베트남에서 생산된 연자육(삼홍건재약업사, Korea)을 추출물 제조에 사용하였다. 분쇄물 50 g을 용매인 70% 에탄올 500 mL에 넣어 초음파추출(ultrasonic cleaner, (주)대한과학, Korea)을 진행한 후 filter paper (F1002; CHMLAB Group, Spain)로 여과시켰다. 여과된 추출용액 345 g을 회전증발농축기(Rotavapor^® R-300; BUCHI Korea, Korea)로 용매를 제거하여 추출물 32.5 g을 얻었다. 각 추출물은 -20℃에 보관하여 사용하였다.

본 실험에서는 B16F10 melanoma 세포(ATCC, USA), 인간 각질형성세포인 HaCaT 각질형성세포(ATCC, USA)을 구입하여 사용하였으며, Dulbecco`s modified eagle medium (DMEM; Biowest, France)에 10% fetal bovine serum (FBS; Biowest)과 1% penicillin-streptomycin (PS; Gibco, Australia)을 포함시켜 37℃, 5% CO₂의 조건으로 세포배양기(Thermo Fisher Scientific, USA)에서 배양하였다.

각 추출물이 세포 독성을 유발해 세포 생존에 영향을 미치는지 알아보기 위하여 water-soluble tetrazolium salt (WST-1) assay를 이용해 세포 생존율을 측정하였다. 96-well plate에 B16F10 세포를 well당 3000 cells/well로 분주하여 배양하였다. 24 h 후. 연자육과 연자방 추출물을 각각 0, 0.01, 0.05, 0.1, 0.2, 0.5, 1% 농도로 처리해 다시 세포배양기에서 24 h 동안 배양하였다. 배양 후 EZ-cytox Cell Viability Assay Kit (Dogen, Korea)를 30 min 동안 처리하고 iMark microplate reader (Bio-Rad, USA)를 이용해 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.

세포 생존율(%)=시료첨가군의 흡광도/대조군의 흡광도×100

96-well plate에 phosphate buffered saline (pH 6.8, PBS; Biowest, France), 1000 unit/mL mushroom tyrosinase (Sigma-Aldrich, USA) 10 μL와 각 추출물을 분주하여 10 mM L-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA; Sigma-Aldrich) solution 10 μL과 37℃, 15 min 반응시켰다. 이후 490 nm에서 iMark microplate reader (Bio-Rad)로 흡광도를 측정하였다. Tyrosinase 활성 저해 정도는 다음 수식을 통해 무처리군과 추출물 처리군의 흡광도 감소율로 나타내었다(Sripathi & Lalitha, 2016).

감소율(%)=[1-(시료첨가군의 흡광도/무첨가군의 흡광도)]×100

B16F10 세포를 60-mm cell culture dish에 2.5×10⁵ cells/well로 분주하여 24 h 배양한 뒤, 연자육 추출물과 연자방 추출물을 농도별로 처리해 48 h 배양하였다. 음성대조군으로 α-melanocytestimulating hormone (α-MSH; Sigma-Aldrich) 100 nM을 사용하였으며, 양성대조군으로는 arbutin 500 μM을 처리하였다. 시료 처리 48 h 후, PBS로 두 차례 세척한 뒤 세포를 회수하여 원심분리(12,000 rpm, 1 min)하였다. 상층액을 제거한 후, Radiommunoprecipitation assay (RIPA) lysis buffer를 이용해 용해시키고 세포용해물을 2 mM L-DOPA와 함께 37℃, 1 h 조건으로 반응시켰다. 이후 iMark microplate reader (Bio-Rad, USA)를 이용해 490 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포용해물의 단백질 정량은 BCA solution kit (Thermo Fisher Scientific, USA)를 사용하여 수행되었다. 데이터는 처리군을 무처리군에 대한 비율로 나타내었다.

감소율(%)=[1-(시료첨가군의 흡광도/무첨가군의 흡광도)]×100

B16F10 세포를 60 mm cell culture dish에 2.5×10⁵ cells/well로 분주하여 24 h 동안 배양한 뒤, 연자육 추출물과 연자방 추출물을 농도별로 처리해 48 h 배양하였다. 음성대조군으로 100 nM α-MSH를 사용하였다. 수확한 cell pellet을 촬영 후, 1 N sodium hydroxide (NaOH; Ducksan, Korea)로 용해시키고 세포용해물을 96-well plate에 분주하였다. 이후 iMark microplate reader (Bio-Rad)를 이용해 490 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포용해물의 단백질 정량은 BCA solution kit를 사용하여 수행되었다. 데이터는 처리군을 무처리군에 대한 비율로 나타내었다.

멜라닌 양(%)=시료첨가군의 흡광도/대조군의 흡광도×100

B16F10 세포에 α-MSH 100 mM과 0.2, 0.5%의 연자육 추출물, 0.5, 1%의 연자방 추출물을 처리한 뒤 24 h 동안 배양하였다. 추가로, B16F10 세포에 α-MSH 100 mM과 0.5%의 연자육 추출물, 1%의 연자방 추출물 처리 24 h 후에 CHX (Sigma-Aldrich) 50 μg/mL을 처리해 0, 4, 8 h 동안 배양하였다(Calvo et al., 1999). 이후 얻은 cell pellet을 RIPA buffer를 이용해 용해시키고 ice에서 20 min동안 incubation한 뒤, 12,000 rpm에서 30 min 동안 원심분리하였고 상층액을 BCA solution kit로 정량하였다. 세포용해물은 5X sample buffer (Bio-Rad)을 첨가해 7 min간 가열 후 ice에서 20 min동안 안정화시켜 단백질을 분리하였다. 분리된 단백질을 membrane으로 transfer하고 5% skim milk로 30 min간 blocking한 뒤, β-actin, tyrosinase 1차 antibody를 넣고 overnight 처리하였다. 실험에 사용한 antibody 정보는 Table 1과 같다. 이후 1X TBST로 10 min씩 3번 세척하고 2차 antibody를 1 h 동안 처리해 다시 동일한 세척 과정을 거쳐 ECL (Bio-Rad)과 반응시켜 FUSION solo S (Vilber, France)로 확인하였고 image J program으로 분석하였다.

연자육, 연자방 추출물의 HaCaT 세포에 대한 염증 유발 여부와 B16F10 세포 내 tyrosinase 발현량 변화를 알아보기 위해 qRT-PCR을 통해 mRNA 발현을 분석하였다. IL-1β의 음성 대조군으로 lipopolysaccharide (LPS; Sigma-Aldrich) 1 μg/mL을 사용하였고 HaCaT 세포에 LPS와 농도별 추출물들을 각각 처리한 후 24 h 동안 배양하였다. 또한, α-MSH를 처리한 B16F10 세포에 농도별 추출물들을 처리하고 24 h 동안 배양하였다. 이후 RiboExTM Total RNA Isolation Solution (GeneAll Biotechnology, Korea) 1 mL을 이용해 세포를 용해시켰다. 세포 용해물에 클로로포름(Sigma-Aldrich) 200 µL을 넣고 12,000 rpm, 4℃에서 15 min동안 원심 분리를 진행한 후 상층액을 분리하여 동량의 아이소프로판올(Merckmillipore, Germany)을 첨가하였다. Inverting 한 용액을 -20℃, 1 h incubation시킨 후 12,000 rpm, 4℃에서 20 min 동안 원심분리하였다. 침전된 RNA를 제외한 나머지를 버리고 70% 에탄올(Merck-Millipore, USA)을 넣어 12,000 rpm, 4℃에서 10 min동안 원심분리 후 에탄올을 제거하였다. 그 후, nuclease free water (Affymetrix, USA)로 RNA를 용해시켜 total RNA를 추출해 MaestroNano Micro-volume Spectrophotometer (MN913; Maestrogen, USA)로 RNA 순도와 농도를 A260/A280 파장에서 측정하였다. Oligo dT (Bionics, Korea), dNTP (Takara, Japan), DTT (Invitrogen, USA), M-MLV reverse transcriptase (Invitrogen)를 사용해 complementary DNA (cDNA)를 합성하였다. 이후 denaturation (95℃, 15 min), denaturation (95℃, 15 s), annealing (60℃, 30 s), polymerization (72℃, 30 s) 과정을 40 cycle동안 반복해 qRT-PCR을 진행하였다. 각 유전자의 threshold cycle (C_t)값을 GAPDH 발현에 대한 C_t값으로 표준화한 후에 C_t값의 변화량을 비교하여 상대적인 유전자의 발현 정도를 정량 분석하였다. 실험에 사용했던 유전자 primer 정보는 Table 2과 같다.

각 연구결과는 독립적으로 3회 반복 실험하여 진행되었다. 통계분석 데이터는 평균±표준편차(mean±standard deviation, Mean±S.D.)로 표기하였고 그래프의 통계 분석은 GraphPad prism을 사용하여 생성되었다. One-way ANOVA 또는 two-way ANOVA는 정규분포 데이터를 평가하는 데 사용되었으며 Tukey's test는 다중 비교를 수정하는데 사용되었다. *p-value 값이 0.05 미만일 때 통계적으로 유의하게 차이가 있다고 판정하였다.

미백 효능을 확인하기 위한 실험을 진행하기에 앞서 B16F10 세포에 대한 연자육 및 연자방 추출물의 세포독성을 조사하기 위해 WST-1 assay를 수행하였다(Kang, 2020). 가장 높은 세포 독성을 갖는 농도에서 92% 이상의 세포 생존율을 나타냈으며 이 또한 유의미한 세포 독성을 갖는 것으로 볼 수 없으므로 시료를 처리하지 않은 대조군과 시료를 각 농도별로 처리한 그룹 모두 세포 생존율에 영향을 미치지 않았다(Figure 1A). 따라서 이후 실험에서는 0.2%, 0.5%의 연자육 추출물과 0.5%, 1.0%의 연자방 추출물을 처리하여 미백 효능 실험을 진행하였다. 또한, 본 연구의 목적은 연자육 및 연자방 추출물을 화장품 소재로서 피부에 도포하였을 때의 효능을 확인하는 것이다. IL-1β는 통증, 염증 및 자가면역 상태와 관련된 염증성 cytokine이다(Ren & Torres, 2008). IL-1β의 과발현은 다양한 질병상태에서 발생하는 병태생리학적 변화와 관련이 있다(Dinarello, 2004; Braddock & Quinn, 2004; Dinarello, 1996). 따라서 두 추출물의 미백 효능 여부를 실험하기에 앞서 추출물이 화장품 소재로서 피부에 적용되었을 때의 안전성을 검증하기 위해 인간각질형성 세포인 HaCaT 세포 내 추출물 처리에 따른 IL-1β의 mRNA 발현을 분석하였다(Nisticò et al., 2010). 무처리군과 1 μg/mL의 LPS를 처리한 음성대조군을 비교하였을 때 음성대조군에서 IL-1β mRNA의 발현량이 32% 증가하였지만, 추출물을 처리한 결과, 무처리군에 비해 IL-1β의 발현량이 0.2%, 0,5% 연자육 추출물에 의해 각각 41%, 63% 감소하였으며, 0.5%, 1.0% 연자방 추출물에 의해서 41%, 61% 감소하였다(Figure 1B). 이를 통해 연자육 및 연자방 추출물이 염증성 cytokine인 IL-1β의 mRNA 발현을 억제하였기 때문에 해당 추출물들의 IL-1β를 통한 염증 유발 가능성을 배제할 수 있으며, 화장품 소재로서의 안전성을 검증하였다.

B16F10 세포에서 연자육과 연자방 추출물이 α-MSH에 의해 유도된 melanogenesis를 감소시키는지 알아보기 위해 0.2%, 0.5% 연자육(Figure 2A)과 0.5%, 1.0% 연자방(Figure 2B)을 48 h 동안 B16F10 세포에 처리한 후 melanin content assay를 진행했으며 양성대조군으로는 arbutin을 사용하였다. α-MSH를 처리한 대조군에서 melanin의 양이 유의하게 증가했으며 arbutin 처리 시 각각의 실험에서 51%, 31%의 멜라닌 감소량을 보였다. 연자육 추출물(0.2%, 0.5%)과 연자방 추출물(0.5%, 1.0%)을 처리했을 때 melanin의 양이 연자육 추출물에 의해 20%, 37% 감소하였으며, 연자방 추출물에 의해 14%, 24% 감소하였으며 이는 농도 의존적인 수치임을 확인하였다.

멜라닌은 효소 촉매 반응과 화학 반응의 조합에 의해 형성되는데, melanogenesis 과정에서 tyrosine과 dopa는 tyrosinase에 의해서 dopaquinone으로 산화된다. 멜라닌 생성은 tyrosine의 산화에서부터 시작되며 이 단계는 멜라닌 합성의 rate-limiting 단계이다(Chang, 2009). 따라서 세포 내에서 melanogenesis 과정에 관여하는 가장 중요한 단백질인 tyrosinase의 활성을 저해하는지 알아보기 위해 cellular tyrosinase activity assay를 진행하였다(Figure 2C) (Chang, 2009; Baek & Lee, 2015). α-MSH와 연자육 추출물 0.2%, 0.5%와 연자방 추출물 0.5%, 1.0%를 함께 처리하였고, 양성대조군으로는 arbutin을 사용하였다. 실험 결과를 통해 추출물이 B16F10 세포 내에서 cellular tyrosinase의 활성을 0.2%, 0.5%에 의해 21%, 24% 감소시켰으며, 0.5%, 1.0% 연자방 추출물에 의해 18%, 27% 감소시킴으로써 농도 의존적으로 저해함을 확인하였다. 이는 세포 내 tyrosinase 발현이 억제되거나 효소 활성이 직접적으로 억제되어 cellular tyrosinase의 활성이 저해된 결과이므로, 추출물이 MITF와 같은 상위 기전과 관계없이 tyrosinase의 효소 활성을 직접적으로 저해하는지 확인하기 위해 in vitro mushroom tyrosinase inhibition assay (Shim, 2019)를 진행하였다. L-DOPA 단독처리군에 비해 추출물 처리군에서 tyrosinase 활성이 감소하였고 0.5, 1%의 연자육 처리군에서 각각 29%, 32%의 감소율을 보였으며, 같은 농도의 연자방 처리군에서 각각 15%, 21% 감소율을 보이며 유의한 결과를 나타냈다(Figure 2D). 추출물이 tyrosinase의 효소 활성을 직접적으로 조절하여 cellular tyrosinase의 활성을 저해했음을 확인했고, 이는 곧 melanogenesis 과정을 억제해 melanin 합성량의 감소로 이어진다.

이전 실험 결과를 통해, 두 추출물이 tyrosinase 활성을 직접적으로 저해한다는 것을 확인하였다. 또한 두 추출물을 처리한 B16F10 cell 내 tyrosinase를 추출하여 L-DOPA와 반응시켰을 때, 반응이 감소하는 것도 확인하였다. 이는 cell 내에서 시료에 의한 tyrosinase 활성 감소에 의한 것뿐만 아니라 시료에 의한 tyrosinase의 양 감소에 의한 것일 수도 있다. 따라서 추출물 처리에 의한 tyrosinase protein level의 변화를 확인하기 위해 B16F10 세포에 α-MSH으로 멜라닌 합성을 자극하고 연자육 추출물 0.2, 0.5%와 연자방 추출물 0.5, 1%를 처리한 후, Table 1에서 언급된 antibody를 사용하여 immunoblotting을 진행하였다. 무처리군에 비해 α-MSH 단독 처리군에서 tyrosinase protein level이 증가하였고 추출물을 처리함에 따라 농도 의존적으로 발현량이 감소하였다(Figure 3A). 이후, tyrosinase의 protein level 감소가 tyrosinase의 mRNA 양 감소에 의한 것인지를 확인하는 실험을 진행하였다. 이전 실험과 동일한 조건으로 시료를 처리한 후, Table 2에서 언급된 primer를 사용하여 qRT-PCR을 통해 tyrosinase mRNA 발현량의 변화를 확인하였다. α-MSH 단독처리군의 경우, 무처리군에 비해 tyrosinase mRNA 발현량이 증가하였지만 농도별 추출물 처리 조건에서는 유의한 변화를 확인할 수 없었다(Figure 3B). α-MSH에 의해 증가된 tyrosinase 단백질 발현량이 두 추출물 처리에 의해 감소하는 것은 tyrosinase mRNA 양 조절과 관련이 없음을 확인하였다. 연자육 및 연자방 추출물이 tyrosinase protein의 stability를 감소시켜, tyrosinase의 단백질 분해를 촉진시키는지에 대한 여부를 알아보기 위한 실험을 진행하였다(Buchanan, 2016). 따라서 추출물 처리 24 h 후 CHX 0, 4, 8 h 간 처리를 통해, 시간에 따른 tyrosinase protein level을 확인하였다. CHX 처리 4 h 후, 단백질 양의 유의미한 변화를 관찰할 수 없었으나, 8 h 후, 무처리군에 비해 0.5% 연자육 추출물과 1.0% 연자방 추출물 처리군에서 각각 62%와 72%의 tyrosinase 단백질 발현량 감소율을 보였다(Figure 3C). 따라서 본 연구는 각 추출물이 tyrosinase의 post-translational modification 과정에 관여하여 tyrosinase 반감기 감소에 따른 조절을 통해 B16F10 cell 내에서 α-MSH에 의한 melanogenesis를 저해함을 입증한다.