인간진피섬유아세포에서 Type I Procollagen 발현 촉진 및 MMP-1 발현에 대한 Helichrysum italicum 에센셜 오일의 효과 및 주름개선인체효능평가
요약
목적
본 연구는 Helichrysum italicum 에센셜 오일(HIEO)의 항주름 화장품 소재로서의 가능성을 검증하기 위해 인간 진피 섬유아 세포(HDF)를 이용하여 세포 독성, MMP-1 발현 억제, 및 type I procollagen 발현 촉진 효과, 눈가주름 개선 효과를 평가하고자 하였다.
방법
HDF 세포를 대상으로 MTT assay를 통해 세포 독성을 평가하였고, ELISA를 이용하여 HIEO의 Type I procollagen 발현 촉진 효과와 UV-A에 의해 유도된 MMP-1 발현 억제 효과를 확인하였으며, 40대-60대 평균나이 56세 성인21명을 대상으로 ANTERA 3D를 이용한 시험 물질 사용 전과 2주 사용 후, 4주 사용 후의 피부 눈가주름 개선도를 분석하였다.
결과
세포 독성 시험에서 HIEO는 0.003125-0.05 % (v/v) 농도 범위에서 90% 이상의 세포 생존율을 유지하여 무독성 범위임을 확인하였다. Type I procollagen 발현 분석에서는 HIEO가 0.035 % (v/v) 농도에서 통계적으로 유의하게(p<0.01) 19.6% procollagen 생성을 증가시켰으며, 0.05 % (v/v) 농도에서 27.9% 유의하게(p<0.01) 증가시켰다. 또한, HIEO는 0.035 % (v/v) 농도에서 UV-A 유도 MMP-1 발현을 통계적으로 유의하게 억제하였으며(p<0.05), 억제율은 9.5%였고, 0.05 % (v/v) 농도에서 15.1% 유의하게 억제하였다(p<0.01). 피부 눈가주름 개선평가에서 피부의 주름을 나타내는 wrinkles small값이 시험물질 사용 전과 비교하여 시험물질 도포부위에서 2주 사용 후 5.92%, 4주 사용 후 11.63%, 대조물질 도포부위에서 2주 사용 후 0.55%, 4주 사용 후 2.38% 감소되는 변화를 나타냈으며, 총 4주간의 시험 기간 동안 시험 시료를 사용한 시험 부위는 시험 전에 비해 시험 2주 후부터 통계적으로 유의한 수준(p<0.001)으로 눈가 주름 지수가 감소하였다.
결론
이상의 결과를 종합하면, HIEO는 세포 독성 범위 내에서 MMP-1 발현 억제와 type I procollagen 발현 촉진 효과를 동시에 나타내었고, 피부 눈가주름 개선효과를 나타내어 항주름 기능성 화장품 소재로서의 활용 가능성을 시사한다.
핵심용어: 헬리크리섬 에센셜 오일, MMP-1, Type I procollagen, 항주름, 화장품 소재
Abstract
Purpose
This study evaluated the anti-wrinkle potential of Helichrysum italicum essential oil (HIEO) as a cosmetic ingredient by assessing cytotoxicity, ultraviolet A radiation (UV-A)–induced matrix metalloproteinase-1 (MMP-1) expression inhibition, type I procollagen production stimulation in human dermal fibroblasts (HDFs), and periorbital wrinkle improvement in humans.
Methods
Cytotoxicity in HDFs was identified using the MTT assay. The stimulatory effect of HIEO on type I procollagen and its inhibitory effect on UV-A–induced MMP-1 expression were quantified using enzyme-linked immunosorbent assay. Human use test was conducted in 21 healthy adults aged 40–60 years (mean age, 56 years). Periorbital wrinkle changes were analyzed with ANTERA three-dimensional at baseline, 2 weeks, and 4 weeks.
Results
In the cytotoxicity assay, HIEO maintained ≥90% cell viability across 0.003125%–0.05% (v/v), indicating a non-cytotoxic range. Type I procollagen analysis revealed that HIEO significantly increased Type I procollagen production by 19.6% and 27.9% at 0.035% (v/v) and 0.05% (v/v), respectively (both p<0.01). Furthermore, HIEO significantly suppressed UV-A–induced MMP-1 expression by 9.5% at 0.035% (v/v) (p<0.05) and 15.1% at 0.05% (v/v) (p<0.01). Clinical periocular wrinkle assessment revealed decreased Wrinkles-small index (arbitrary units) at the HIEO-treated site by 5.92% at 2 weeks and 11.63% at 4 weeks, whereas the control site (jojoba oil) decreased by 0.55% and 2.38%, respectively. Over 4 weeks, the experimental site exhibited a significantly reduced wrinkle index from baseline beginning at 2 weeks (p<0.001).
Conclusion
Within non-cytotoxic concentrations, HIEO demonstrated dual activity by inhibiting MMP-1 expression and enhancing type I procollagen production in HDFs. Moreover, it improved periorbital wrinkles in a 4-week human use test. These findings indicate that HIEO holds potential as an anti-wrinkle functional cosmetic ingredient.
Keywords: Helichrysum italicum essential oil, MMP-1, type I procollagen, Anti-wrinkle, Cosmetic ingredient
中文摘要
目的
本研究通过使用人类真皮成纤维细胞(HDF)评估细胞毒性、MMP-1表达抑制、I型前胶原表达促进和鱼尾纹改善效果，验证意大利蜡菊精油(HIEO)作为抗皱化妆品材料的潜力。
方法
采用MTT法鉴定HDFs的细胞毒性。采用酶联免疫吸附试验定量HIEO对I型前胶原的刺激作用及其对UV-A诱导的MMP-1表达的抑制作用。对21名40-60岁(平均年龄56岁)健康成人进行人体临床试验。采用ANTERA三维扫描仪分析基线、2周和4周时眶周皱纹的变化。
结果
在细胞毒性试验中，HIEO在0.003125%至0.05% (v/v)浓度范围内维持细胞活力≥90%，表明该浓度范围无细胞毒性。I 型前胶原分析显示，HIEO在0.035% (v/v)和0.05% (v/v)浓度下分别显著增加了19.6%和27.9% (p<0.01)。此外，HIEO显著抑制了UV-A诱导的MMP-1表达，在0.035% (v/v)浓度下，分别降低了9.5%(p<0.05)和15.1% (p<0.01)。临床眼周皱纹评估显示，HIEO治疗部位的细小皱纹指数在2周和4周时分别下降5.92%和11.63%，而对照组(荷荷巴油)分别下降0.55%和2.38%。4周内，实验部位的皱纹指数自2周起显著低于基线水平(p<0.001)。
结论
在无细胞毒性浓度下，HIEO表现出双重活性，可抑制MMP-1表达并促进HDF中的I型前胶原生成。此外，在为期4周的人体临床试验中，HIEO还改善了眼周皱纹。这些结果表明HIEO具有作为抗皱功能性化妆品成分的潜力。
关键词: 意大利蜡菊精油, MMP-1, I型前胶原蛋白, 抗皱, 化妆品成分
Introduction
피부 노화는 크게 내인성과 외인성 요인에 의해 진행된다. 내인성 노화는 시간의 흐름에 따라 자연스럽게 나타나는 생리적 변화인 반면, 외인성 노화는 흡연, 음주, 영양 부족, 자외선 노출과 같은 외부 환경 요인에 의해 촉진된다( Ju et al., 2024). 이 중 자외선은 피부 구조와 기능에 가장 큰 영향을 미치는 요인으로 알려져 있으며, 콜라겐의 붕괴와 엘라스틴 축적 저해를 통해 피부 탄력 저하와 주름 형성에 직접적으로 관여한다( Lee et al., 2022; Han & Kim, 2024). 자외선은 파장에 따라 UV-A (320-400 nm), UV-B (290-320 nm), UV-C (200-290 nm)로 구분되며, UV-C는 대부분 오존층에 의해 흡수되므로 지표면에는 도달하지 않는다. 따라서 피부 광노화에는 주로 UV-A와 UV-B가 관여한다( Ji et al., 2013). 자외선과 같은 외부 자극은 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)의 생성을 촉진하여 피부 세포 내 산화적 손상을 일으킨다. 과도하게 생성된 ROS는 receptor tyrosine kinase (RTK)와 receptor protein tyrosine phosphatase (RPTP)의 균형을 무너뜨려 MAPK 및 NF-κB 신호 경로를 활성화시키고, 이로 인해 콜라겐 합성이 억제되는 동시에 matrix metalloproteinases (MMPs)의 발현이 증가한다( Kim et al., 2023). MMPs는 현재 약 28종이 알려져 있으며, 이 중 MMP-1은 fibroblast collagenase로서 type I collagen을 분해하는 대표적인 효소로, 피부 주름 형성에 핵심적인 역할을 한다( Jang & Lee, 2024). 진피의 주요 구성 성분인 type I collagen은 피부 탄력과 구조 유지에 중요한 역할을 하며( Roh et al., 2009; Park et al., 2017), 그 감소와 분해는 피부 노화의 중요한 기전으로 알려져 있다( Um, 2021). 헬리크리섬( Helichrysum italicum)은 국화과( Asteraceae)에 속하는 다년생 약용 식물로, 지중해 지역에 주로 분포하며 지역·계통에 따라 성분 프로파일이 다르지만 neryl acetate, α-pinene, γ-curcumene 등이 주요 성분으로 빈번히 보고된다( Servi & Servi, 2022). 선행연구에 따르면, Helichrysum italicum 에센셜 오일 및 관련 제형은 항균·항염·항산화 활성을 보여 왔고( Bezek et al., 2022; Petelin et al., 2022; Kamalli et al., 2021), 동물모델 및 제형 연구에서 창상 치유 촉진 가능성이 제시되었다( Andjić et al., 2021). 또한 in vitro 에서는 항콜라게나제·항엘라스타제 활성이 보고되어( Fraternale et al., 2019) 기질 분해 억제 관점의 항노화 가능성을 시사한다. 아울러 수증기 증류 부산물인 하이드롤라트 역시 피부줄기세포·섬유아 세포 공동배양에서 콜라겐 관련 지표를 개선하고( Serra et al., 2024; Serra et al., 2023), 일부 연구에서는 Helichrysum italicum 추출물이 FGF-2, HAS-2 증가와 MMP-9 조절 등 피부 기질 대사에 유리한 변화를 유도한다고 보고하였다( Pekmezci & Türkoğlu, 2023). 성분 측면에서는 neryl acetate가 피부 장벽 관련 생물학적 활성의 주요 매개 성분으로 작용할 수 있다고 보고하였다( Lemaire et al., 2023). 그럼에도 불구하고, 이러한 연구 다수는 항균·항염·창상 치유 혹은 장벽 강화 중심이며, 인간 진피 섬유아세포 모델에서의 항주름 핵심 지표 Type I procollagen 발현 및 MMP-1 발현에 대한 직접적 검증은 제한적이다. 특히, 에센셜 오일 자체(순수 또는 희석 상태)가 동일 조건에서 두 지표에 미치는 동시적 영향을 체계적으로 비교·평가한 연구는 드문 편이다. 이에 본 연구에서는 인간 진피 섬유아세포를 대상으로 Helichrysum italicum 에센셜 오일(HIEO)의 Type I procollagen 발현 촉진 효과와 MMP-1 발현 억제 효과를 평가하고, 눈가주름개선 임상효능을 평가함으로써, 항주름 기능성 화장품 소재로서의 활용 가능성을 탐색하고자 하였다.
Methods
1. 시험 재료
Helichrysum italicum 에센셜 오일은 남유럽발칸반도 보스니아 헤르체고비나 지역의 Novi Dan d.o.o.(New Day Ltd.)사에서 구입하였다. 본 오일은 6월-7월 사이 수확한 헬리크리섬을 증류법으로 추출하여 제조된 것으로, 5-25℃사이 고온 또는 저온과 직사광선을 피하여 보관하였다.
2. 시험 방법
1) 세포 독성 시험
본 시험에 사용한 human dermal fibroblast (HDF)는 Ubigene Biosciences (China)기관에서 분양받아 사용하였다. Helichrysum italicum 에센셜 오일 2 mL에 EtOH (Greagent, China) 8 mL를 가하여 20% (v/v) 농도의 stock 용액으로 제조 직후, 60 s 동안 vortexing (Vortex-Genie 2; Scientific Industries, USA) 하여 균질화한 후 실험에 사용하였다. 세포 처리 시 EtOH의 최종 농도는 1% (v/v) 이하가 되도록 조절하여 Dulbecco's Modified Essential Medium (DMEM; Procell, China) 배양액으로 단계별로 희석하였고 세포는 최종 0.003125-0.2% (v/v)의 농도로 처리하였다. 세포 배양은 무균 환경에서 1×105 cells/mL의 HDF 세포(Ubigene Biosciences)를 10% fetal bovine serum (FBS; Gibco, USA), 1% Penicillin/Streptomycin (P/S; Solarbio, China)이 첨가된 DMEM 배양액으로 37℃, 5% CO2 인큐베이터(BNP-30CW; Yiheng, China)에서 배양하였다. 세포가 포화상태에 도달하기전 대수기 일 때 PBS로 세척하고, 0.25% Trypsin-EDTA 로 분리한 뒤 cell counter로 세포의 수를 계산하였다. DMEM 배양액으로 세포를 0.8×105 cells/mL 농도로 희석 후 96-well cell culture plate에 well당 100 μL 분주하고 CO2 인큐베이터에서 24 h 배양하였다. 이후 배양액을 제거한 뒤 시료가 농도별로 포함된 배양액을 첨가하였으며, 대조군에는 동일한 부피의 배양액을 첨가하였다. 모든 실험은 농도별 3회 반복(n=3)으로 수행하였다. 48 h 배양 후, 배양액을 제거하고 세포에 최종 0.5 mg/mL의 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5 diphenyltetrazolium bromide (MTT; Sigma, USA) 을 처리하였다. CO2 인큐베이터에서 2 h 배양 후 배양액을 제거하고, 각 well에 DMSO 100 μL을 첨가하였다. DMSO 처리 후 plate shaker (WKB-100; Shanghai Jing Xin, China)에서 300 rpm으로 진탕하여 formazan 결정이 균일하게 분산되도록 하였으며 well 간 편차를 최소화하기 위해 37℃에서 10 min간 300 rpm으로 반응시킨 뒤 microplate reader (Spectra Max Plus 384; Molecular Devices, USA)로 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.
Cell viability (%)=(시료처리군의 흡광도/무처리군의 흡광도)×100
2) Type I Procollagen 발현 촉진 시험
Type I procollagen은 Human Type I procollagen ELISA kit (CD16691; CHUNDUBIO, China)를 사용하여 제조사 지침에 따라 정량하였으며, 총 단백질량은 BCA Protein Assay Kit (BCA; Biosharp, China)를 사용하여 제조사 지침에 따라 정량하였다. 무균 환경에서 1×105 cells/mL의 HDF 세포를 10% (v/v) FBS (Gibco)과 1% (v/v) P/S (Solarbio)이 첨가된 DMEM 배양액에서 37℃, 5% CO2 인큐베이터 조건으로 배양하였다. 세포가 포화 상태에 도달하기 전 대수기에 PBS로 세척한 뒤, 0.25% Trypsin-EDTA (Gibco, USA)로 분리하고 cell counter를 이용하여 세포 수를 계산하였다. HDF 세포는 12-well cell culture plate에 1×105 cells/well 농도로 분주하여 동일한 배양 조건에서 24 h 동안 배양하였다. 이후 serum-free DMEM (DMEM; Procell, China) 배양액으로 교체하여 6 h 동안 starvation을 유도하였다. 이어서 배양액(serum-free DMEM)에 시료를 희석하여 48 h 동안 처리하였다. 양성 대조군으로는 TGF-β1 (Adamas life, China) (10 ng/mL)을 처리하였다. 48 h 후 세포 배양액을 수거하여 ELISA를 진행하였다.
Type I procollagen 발현 촉진율(%)=(보정된 시료처리군의 발현량/보정된 무처리군의 발현량)×100
3) MMP-1 발현 저해 활성 시험
MMP-1은 Human MMP-1 ELISA kit (CD10746; CHUNDUBIO)를 사용하여 제조사 지침에 따라 정량하였으며, 총 단백질량은 BCA Protein Assay Kit (BCA; Biosharp, China)를 사용하여 제조사 지침에 따라 정량하였다. 무균 환경에서 1×105 cells/mL의 HDF 세포를 10% (v/v) FBS (Gibco)과 1% (v/v) P/S (Solarbio)이 첨가된 DMEM 배양액에서 37℃, 5% CO2 조건으로 배양하였다. 세포가 포화 상태에 도달하기 전 대수기에 PBS로 세척하고, 0.25% Trypsin-EDTA 로 분리한 후 cell counter를 이용하여 세포 수를 계산하였다. HDF 세포를 6-well culture plate에 1×105 cells/well 농도로 분주하여 24 h 동안 배양한 뒤, serum-free DMEM으로 교체하여 6 h starvation을 유도하였다. 이후 PBS 1 mL로 세포를 세척한후 UV-A (VL-1000A; V-Leader Biology, China) 6.7 J/cm2를 조사하였다. UV-A 조사 후 시료를 희석한 serum-free DMEM 배양액을 첨가하여 48 h 동안 처리하였다. 양성 대조군으로는 TGF-β1 (10 ng/mL)을 처리하였다. 48 h 후 배양 상등액을 ELISA하여 진행하였다.
MMP-1 발현 억제율(%)=100-[(보정된 시료처리군의 발현량/보정된 무처리군의 발현량)×100]
4) 통계분석
실험 결과의 통계적 유의성은 Microsoft사의 Office Excel 2007의 t-test (Independent t test, 양측 검증) 기능을 이용하여 확인하였으며, p 값이 0.05 미만일 때 통계적으로 유의 하다고 판단하였다.
3. 눈가주름 개선 임상 시험 평가
1) 연구대상자 선정 및 제외 기준
본 연구는 HIEO의 눈가주름 개선 효능을 평가하기 위해 2025년 2월 12일-2025년 3월 12일 4주동안 실시하였으며, 선정 기준에 부합하는 40-60세 성인 21명(평균 연령 56세)이 참여하였다( Table 1). 모든 대상자는 시험 목적·방법·예상 위험성에 대해 설명을 듣고 자발적으로 서면 동의 후 참여하였다. 대상자는 급·만성 피부질환 또는 전신 질환이 없고, 시험기간 동안 추적 관찰이 가능한 자로 하였다. 제외 기준으로는 임신/수유 중이거나 임신 가능성이 높은 자, 최근 1개월 내 스테로이드 외용제를 지속 사용한 자, 최근 6개월 내 동일·유사 시험 참여자, 민감성/과민성 피부 소견자, 시험 부위에 점·염증성 병변·홍반·모세혈관확장 등 이상 소견이 있는 자, 연구 시작 전 3개월 내 동일·유사 효능의 화장품·의약품을 시험 부위에 사용한 자, 연구 시작 전 6개월 내 시험 부위에 시술을 받은 자, 그 외 시험책임자가 부적합하다고 판단한 자이다. 본 연구는 대한피부과학연구소 IRB 승인(승인번호: KDRI-IRB-250168)을 받아서 진행하였다. 그리고 본 연구는 헬싱키 선언, GCP, 및 국내 관련 법규를 준수하였다. 표본수는 식품의 약품안전처(Ministry of Food and Drug Safety, MFDS) 「화장품 표시·광고 실증을 위한 시험방법 가이드라인(2018.03)」 및 기관 내부 기준에 따라 유효 데이터 ≥20명을 확보하도록 계획하였다.
2) 일차첩포자극시험
시험 부위는 착색이나 손상이 없는 등 부위를 선택하였으며, 70% 에탄올로 소독 후 건조하였다. 시험 물질을 피시험자의 등에 15 μL를 finn chamber에 도포 후 plaster로 고정하였다. 부착 24 h 후 패치를 제거하였으며, 제거 후 30 min 안정화 뒤 첫 번째 판독을 실시하였다. 이후 패치 제거 후 24 h (첫 방문 48 h), 48 h (첫 방문 72 h)에도 동일하게 판독을 실시하였다. 판독방법은 피부과 전문의가 국제접촉피부염연구회(ICDRG) 판정기준에 따라 육안 판독하였다. 판정은 −, ±, +, ++, +++, ++++의 여섯 단계로 평가하였으며, 각각을 0, 0.5, 1, 2, 3, 4 점으로 환산하였으며 Table 2와 같다. 일차첩포 자극시험도 대한피부과학연구소 IRB 승인(KDRI-2025-0114-J2)을 받아서 진행하였다.
3) 시험 물질
시험부위(experimental site)에는 HIEO 3% 함유 오일 세럼을, 대조부위(control site)에는 HIEO 무첨가 호호바오일을 적용하였다(동일 제형·점도). 제품은 5-25℃, 차광 보관하였다(성분 및 배치 정보는 Table 3 참조).
4) 시험 설계 및 절차
본 시험은 스플릿-페이스, 단일군, 4주 설계로 진행하였다. 한 피험자에서 좌측 안면은 시험부위, 우측 안면은 대조부위로 배정하여 개인 내 비교를 수행하였다. 피험자는 1일 2회(아침/저녁) 세안 후 지정된 부위에 각 시료를 동일 용량으로 4주간 도포하였다. 모든 방문에서 동일 세안제로 세안 후 항온·항습실(22±2℃, 50±5% RH)에서 30 min 안정화 뒤 측정하였다. 측정 시점은 사용 전(Baseline, Week 0), 사용 2주 후(Week 2), 사용 4주 후(Week 4)였다. 이상반응(소양감, 홍반 등)은 피부과 전문의가 매 방문 및 종료 시 확인하였다. 순응도(90-110%)는 배포량/반납량 확인으로 점검하였으며, 기준 이탈 시 분석에서 제외하였다.
눈가 주름 평가는 ANTERA 3D (Miravex, Ireland)로 수행하였다. 일측 눈가 6×6 cm 정방형 ROI를 설정하고, 전용 소프트웨어(ANTERA CS)에서 wrinkles-small (indentation index, arbitrary units) 지표를 산출하였다. 촬영은 각 시점 동일 세팅으로 시행하였으며, Baseline 이미지와 오버레이 매칭하여 동일 부위를 재측정하였고, 표준화 안면 촬영용 MARK-Vu (Professional Scientific Instrument MARK-Vu; PSI PLUS, Korea)는 기록용으로 사용하였다.
5) 중도탈락 및 안전성 관리
시험기간 중 시료 사용에 따른 홍반, 부종, 인설, 소양감, 작열감, 통증, 따가움 등 이상반응을 피부과 전문의가 평가·기록하였으며, 유해 사례 발생 시 시험 지속 여부를 판단하였다. 과도한 자외선 노출, 과도한 음주·흡연 등 평가를 저해하는 상황 발생 시 시험을 중단하고 보고서에 기록하였다.
6) 통계 분석 방법
통계 분석은 IBM SPSS Statistics ver. 28.0 (IBM Corp., Armonk, USA)을 사용하였고, 유의수준은 양측 p=0.05로 설정하였다. 정규성은 Shapiro–Wilk 검정으로 확인하였다. 반복측정/스플릿-페이스 설계를 고려하여 다음과 같이 분석하였다.
(1) 군내 시간 변화(Baseline, Week 2, Week 4)는 반복측정 일원분산분석(repeated-measures ANOVA)으로 검정하고, 사후비교는 Baseline 대비 Dunnett형 대비 또는 Bonferroni 보정을 적용하였다(구형성 위반 시 Greenhouse–Geisser 보정).
(2) 동일 시점의 군간 비교(시험부위 vs 대조부위)는 대응표본 t-검정(paired t-test)으로 수행하였다.
(3) 개선율(%)이 0과 다른지의 검정은 one-sample t-검정으로 시행하였고, 정규성이 충족되지 않는 경우 Wilcoxon signed-rank 검정을 사용하였다.
정규성을 만족하지 않거나 자료가 순서형/비연속형인 경우에는 비모수 대안을 적용하였다: 군내 시간 변화는 Friedman 검정, 시점별 군간 비교는 Wilcoxon signed-rank 검정(대응), 독립 집단 비교는 Mann–Whitney U 검정을 사용하였다. 초기값(Baseline) 차이를 보정할 필요가 있는 경우 공분산분석(ANCOVA; 공변량= Baseline)을 실시하였다. 모든 결과는 평균±표준편차(mean±SD)로 제시하였다.
Results and Discussion
1. 세포 독성 시험
HIEO를 HDF 세포에 처리한 후 세포 생존율에 미치는 영향을 확인한 결과, 0.003125-0.05% (v/v)의 농도 범위에서 무처리군 대비 90% 이상의 세포 생존율을 나타내었다. 상기의 농도 범위에서 HDF 세포의 생존율에는 유의한 영향이 없는 것으로 확인되었으며 Figure 1에 정리하였다.
2. Type I Procollagen 발현량 측정 시험
세포외기질(extracellular matrix, ECM)의 주요 성분인 콜라겐은 진피층의 섬유아세포에서 생성되는 기질 단백질로, 피부의 주름 형성과 탄력 조절에 중요한 역할을 하며, 전구체인 프로콜라겐(procollagen)으로부터 합성된다( Um, 2021; Jo & Choi, 2023). 본 연구에서는 HIEO이 HDF에서 type I procollagen 합성에 미치는 영향을 평가하였으며, 결과는 Figure 2에 제시하였다. HIEO는 0.035% (v/v), 0.05% (v/v) 농도에서 통계적으로 유의한 수준( p<0.01)으로 type I procollagen 발현을 각각 19.6%, 27.9% 증가시켰다. 그리고 양성 대조군으로 사용한 TGF-β1 (10 ng/mL)은 무처리 대조군 대비 40.5%의 type I procollagen 발현 촉진 효과를 나타내었다. 이러한 결과는 일부 에센셜 오일(EO) 혹은 EO 유래 테르펜 등의 성분이 섬유아세포의 콜라겐 대사에 긍정적으로 작용할 수 있다는 선행 근거와 부합한다. 예컨대 라벤더 EO는 인간 피부 섬유아세포(HSF)에서 ELISA로 type I procollagen의 유의한 증가(0.0001-0.01%)를 보고하였고( Andrys et al., 2018), Hs68 HDF의 UV-B 손상 모델에서는 데카날이 cAMP 경로를 통해 UV-B로 감소한 type I procollagen을 유의하게 회복시켰으며( Kang et al., 2020), α-ionone 역시 Hs68에서 procollagen 관련 지표와 TGF-β 관련 분자를 증가시킨 바 있다( Tong et al., 2019). 다만 라벤더 EO 연구는 세포 기원(HSF)과 적용 농도 범위가 본 연구와 상이하여 정량적 직접 비교에는 한계가 있다. 그럼에도 불구하고, 서로 다른 EO의 성분에서 관찰된 procollagen 촉진 신호는 HIEO의 관찰치가 EO 계열 전반의 생물학적 방향성과 일관됨을 시사한다. 본 연구에서는 총 type I procollagen 생성량만을 평가하였으므로, 신호경로 수준의 인과는 추후 TGF-β/Smad 경로와 cAMP/PKA-CREB 경로의 활성, COL1A1 /1A2 mRNA 발현, 성분 분획 비교 등으로 규명할 필요가 있다. 또한 HIEO는 복합 혼합물로서, 단일 성분 기여도와 성분 간 상호작용을 구분하는 화학-생물학적 접근이 요구된다. 이상의 근거를 종합하면, HIEO는 비독성 범위(≤0.05% v/v)에서 type I procollagen 생성을 유의하게 증대시키며, 이는 항주름 효능의 중요한 분자학적 기반 중 하나로 해석될 수 있다.
3. MMP-1 저해 활성
MMP-1은 피부 세포외 기질(ECM)에서 콜라겐 분해를 촉진하여 주름, 피부 처짐 및 탄력 저하와 같은 노화 현상을 유발하는 주요 효소로 알려져 있다( Kim et al., 2025). 자외선에 노출되면 MMP-1의 발현과 활성이 증가하여 콜라겐 분해가 촉진되고, 이로 인해 주름 형성과 피부 탄력 저하가 발생한다( Bae, 2021). 본 연구에서는 자외선에 의해 유도된 HDF 세포의 MMP-1 발현에 대한 HIEO의 효능을 확인하였으며, 결과는 Figure 3에 제시하였다. HIEO는 0.035 % (v/v), 0.05% (v/v) 농도에서 UV-A 유도 MMP-1 발현을 각각 9.5%, 15.12% 통계적으로 유의하게 억제하였다( p<0.05, p<0.01). 양성 대조군으로 사용한 TGF-β1 (10 ng/mL)은 UV-A 처리에 의해 유도된 MMP-1 발현에 대해 30.7%의 억제 효과를 나타내었다. 본 연구에서 관찰된 UV-A 유도 MMP-1 감소는, HDF 세포에서 ERK/JNK 축을 억제하여 UV-유발 MMP-1 발현을 낮춘 eicosapentaenoic acid (EPA, ω-3)의 선행 결과와 방향성 측면에서 일치한다( Kim et al., 2005). 서론에서 기술한 바와 같이, HIEO는 항콜라게나제·항엘라스타제 활성이 보고되어 있다( Fraternale et al., 2019). 이것은 효소 기반( in vitro enzyme assay)과 HDF 세포 모델이라는 점에서 직접적 정량 비교에는 한계가 있지만 본 연구의 세포 수준 MMP-1 발현 억제와 기질 분해 효소 활성 억제가 기전적으로 상보할 가능성을 뒷받침한다. 종합하면, HIEO의 항주름 효능은 콜라겐 합성 촉진과 기질 분해 효소 억제를 통한 이중 작용으로 설명될 수 있다. 이러한 결과는 HIEO가 항주름 화장품 소재로서의 잠재력을 가짐을 시사한다.
4. 눈가주름 개선 임상효능 평가
1) 일차첩포자극시험
HIEO 이 3% (w/w) 첨가된 오일 세럼으로 24 h 일차첩포자극시험을 실시하였다. 첫 번째 방문 24 h 뒤 패치를 제거 후 30 min, 24시간 후(첫 번째 방문 48 h 후), 48 h 후(첫 번째 방문 72 h 후)에 각각 일차 피부자극 유무를 피부과 전문의가 판정하였다. 피부 반응 판정은 ICDRG 기준 및 PCPC 가이드라인에 의거하였으며, 각 연구 대상자들의 피부 반응 점수를 이용하여 자극 지수를 산출한 결과, 피부자극 지수 0.00점을 얻어 비자극으로 판단하였다.
2) 시험물질 사용 전후의 눈가주름 개선 평가
HIEO가 함유된 오일 세럼의 눈가주름 개선 효능을 ANTERA 3D Wrinkles-small로 평가하였다. 오일 세럼 제형의 HIEO 함량은 3% (w/w)로 설정하였다. 이는 in vitro 조건의 % (v/v)농도와 달리, 실제 피부 도포 시 각질층 장벽·제형 매트릭스·피부 대사 등으로 인해 진피/표피에 도달하는 실효 농도는 제형 함량보다 현저히 낮아지는 점을 고려하였다. 또한 일차첩포자극시험에서 비자극으로 확인되어 피부 적용 안전성을 확보하였고, 안정성과 효능을 종합적으로 고려하여 3% (w/w) 함량을 사용하였다. 연구결과( Figure 4), 시험부위는 Baseline 대비 Week 2에 5.92%, Week 4에 11.63% 감소(개선)하였고, 대조부위는 각각 0.55%, 2.38% 감소하였다. 통계분석 결과, 시험부위는 Baseline 대비 Week 2부터 유의한 감소가 나타났으며( p<0.05), 대조부위의 변화는 작아 통계적으로 유의하지 않거나 보정 후 유의성이 소실되었다. 동일 시점의 군간 비교(시험부위 vs 대조부위)에서도 Week 2 및 Week 4에 유의한 차이가 확인되었다( p<0.05).
Conclusion
본 연구는 인간 진피 섬유아세포(HDF)에서 UV-A로 유도되는 피부 기질 불균형에 대한 Helichrysum italicum 에센셜 오일(HIEO)의 효능을 평가하였다. 그 결과, HIEO는 0.035% (v/v) 농도에서 9.5% (p<0.05), 0.05% (v/v) 농도에서 15.1% MMP-1 발현을 억제하였고(p<0.01), 0.05% (v/v) 농도에서 type I procollagen 생성을 27.9% 유의하게 증가시켰다(p<0.01). 또한 1차 첩포 자극시험에서 자극지수 0.00으로 비자극 판정이 되었으며, 인체 적용 평가에서 눈가 주름이 사용 2주 후 5.92%, 4주 후 11.63% 감소하여 통계적으로 유의한 개선을 보였다(p<0.001). 이러한 결과는 HIEO가 MMP-1 억제와 type I procollagen 촉진을 통해 항주름 효과를 나타내며, 항주름 기능성 화장품 소재로서의 활용 가능성이 높음을 시사한다. 향후에는 제형화 및 장기간 사용에 대한 안전성, 용량-반응 최적화, 기전 검증, 그리고 위약 대조 확대 임상 등을 통해 효능을 추가적으로 확증할 필요가 있다.
Figure 1.
Effect of Helichrysum italicum essential oil (HIEO) on the viability of human dermal fibroblasts.
HIEO was prepared as a 20% (v/v) ethanol stock and applied to HDFs at final concentrations of 0.003125%, 0.00625%, 0.0125%, 0.025%, 0.05%, 0.1%, and 0.2% (v/v). The final ethanol content in all wells was ≤1% (v/v). Data are expressed as % of the untreated control and shown as mean±SD (n = 3). Cell viability remained ≥90% up to 0.05% (v/v) and decreased significantly at 0.1% and 0.2% (v/v). *p<0.05, **p<0.01 (vs. control, independent two-tailed Student’s t-test).
Figure 2.
Effect of Helichrysum italicum essential oil (HIEO) on type I procollagen production in human dermal fibroblasts.
HDFs were treated in serum-free DMEM with HIEO at 0.0125%, 0.025%, 0.035%, and 0.05% (v/v); Untreated cells served as the control, and TGF-β1 (10 ng/mL) as the positive control. Data are mean±SD (n=3). HIEO at 0.035% (v/v) increased type I procollagen by 19.6% and at 0.05% (v/v) by 27.9% versus the untreated control. Asterisks indicate significance vs. untreated control(**p<0.01, ***p<0.001).
Figure 3.
MMP-1 expression in UV-A–exposed HDFs.
(A) Human dermal fibroblasts were irradiated with UV-A (6.7 J/cm²) and then treated for 48 h with Helichrysum italicum essential oil (HIEO) at 0.0125%, 0.025%, 0.035%, and 0.05% (v/v). UV-A also served as control and TGF-β1 (10 ng/mL) as positive control. Secreted MMP-1 in culture supernatants was quantified using ELISA and normalized to total protein (ng/μg protein). (B) Inhibition (rate) of MMP-1 expression by HIEO. Significant decreases were observed at 0.035% (9.5%) and 0.05% (15.1%) versus the control. Values are expressed as mean±SD (n=3). Asterisks indicate significance vs. the control (*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001).
Figure 4.
Changes in wrinkles-small.
(A) Each participant applied a 3% HIEO oil serum to one side of the face (experimental site) and jojoba oil without HIEO to the contralateral side (control) twice daily for 4 weeks. Measurements were obtained with ANTERA 3D on the same periorbital ROI at baseline, 2 week, and 4 week. The experimental site demonstrated significant reductions from baseline at 2 week and 4 week (p<0.001) and was significantly lower than the control at the corresponding visits. (B) Improvement of wrinkles around the eyes. Mean improvement: experimental site: 2 week (5.92%) and 4 week (11.63%); control site: 2 week (0.55%) and 4 week (2.38%). Values are mean±SD (n=21). Statistical significance: within-site (vs. baseline; paired t-test): ***p<0.001; between-site (experimental vs. control at the same visit; paired t-test): ###p<0.001.
Table 1.
Demographic Characteristics of Study Participants (N=21)
|
Characteristic |
N |
% |
|
Sex |
Male |
2 |
9.5 |
|
Female |
19 |
90.5 |
|
Age group (years) |
40s |
5 |
23.8 |
|
50s |
6 |
28.6 |
|
60s |
10 |
47.6 |
|
Mean age, years |
56s |
|
|
|
Total |
|
21 |
|
Table 2.
Scoring system for skin irritation in patch test
|
Score |
Description of the response |
|
0(-) |
No signs of inflammation, normal skin |
|
0.5(±) |
Doubtful or slight reaction |
|
1(+) |
Slight erythema |
|
2(++) |
Moderate erythema with or without partial edema or papules |
|
3(+++) |
Moderate erythema with diffuse edema |
|
4(++++) |
Intense erythema with diffuse edema and vesicles |
Table 3.
Formulation of oil serum in a 4-week clinical trial
|
No. |
INCI |
Concentration (wt%)
|
|
HIEO oil serum |
Placebo |
|
1 |
Simmondsia chinensis (Jojoba) seed oil |
97 |
100 |
|
2 |
Helichrysum italicum flower oil |
3 |
0 |
References
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