Introduction
현대 사회에서의 대기 오염, 자외선(UV) 노출, 스트레스 등 다양한 유해 환경 요인은 피부 산화 스트레스를 유발하여 피부 노화 및 관련 질환을 유발하는 주요 원인으로 작용한다(Araviiskaia et al., 2019; Krutmann et al., 2014; Kim et al., 2021). 산화 스트레스는 활성산소종(ROS)의 과잉 생성과 항산화 방어 시스템 간의 불균형 상태로, 세포 손상을 초래한다. 이러한 손상에 대응하기 위해 인체는 다양한 항산화 방어 기전을 갖추고 있으며, 그 중 nuclear factor erythroid 2-related factor 2 (NRF2) 경로는 대표적인 내인성 항산화 경로로 알려져 있다. NRF2는 산화적 자극에 반응하여 세포핵으로 이동 후, 항산화 반응소자(antioxidant response element, ARE)에 결합하여 heme oxygenase-1 (HO-1), superoxide dismutase 1 (SOD1), NQO1 (NAD(P)H quinone dehydrogenase 1) 등 항산화 효소 발현을 유도함으로써 세포를 보호하는 중요한 역할을 한다(He et al., 2020; Shaw & Chattopadhyay, 2020). 최근에는 이러한 NRF2 경로를 활성화할 수 있는 천연 유래 항산화제에 대한 관심이 증가하고 있으며, 특히 독성 우려가 적고 생물학적 활성이 우수한 식물 유래 소재를 중심으로 활발한 연구가 진행되고 있다(Kang & Lee, 2025; Kim & Park, 2025).
덩굴별꽃(Silene baccifera)은 석죽과(Caryophyllaceae)에 속하는 식물로, 전통적으로 약용소재로 활용되었으며 민간 요법에서는 해열, 진통, 항염 효과가 있다고 전해진다(Mihailov-Krstev et al., 2015). 그러나 과학적 관점에서 덩굴별꽃의 생리활성에 대한 연구는 아직 제한적이다. 관련 선행연구에 따르면 덩굴별꽃에는 페놀류, 플라보노이드, 탄닌, phytoecdysteroids, cucurbitacin류 triterpenoid, 토코페롤 및 토코트리에놀 등의 생리활성 물질이 포함되어 있으며, 이들 화합물은 항산화 및 항염 효능이 있는 기능성 성분으로 보고되었다(Mamadalieva et al., 2014). 특히 덩굴별꽃은 DPPH 라디칼 소거 활성, 지질 과산화 억제 효과가 나타나(Zengin et al., 2018), 다양한 생리활성이 예측된다.
이에 본 연구에서는 덩굴별꽃 추출물의 활성산소종(ROS) 생성 억제 및 NRF2 경로 조절 능력을 중심으로 생리적 효능을 평가하고, 향후 기능성 화장품 원료로서 활용 가능성을 제시하고자 하였다.
Methods
1.덩굴별꽃추출물
덩굴별꽃은 2025년 1월 경기도 안농영동조합에서 구입하여 사용하였다. 덩굴별꽃 시료는 70% 에탄올로 살균한 뒤 증류수로 씻어 건조하였다. 건조된 덩굴별꽃을 가로, 세로 1 mm 이하의 크기로 분쇄한 후, 100 g에 70% 에탄올 2 L를 넣어 상온에서 72시간 동안 침지하였다. 이 과정을 반복하여 추출액을 얻었다. 이 후 와트만 여과지를 이용하여 추출액을 여과한 뒤 동결건조기(Eyela FD1; Rikakikai Co., Japan)를 이용해 7일간 동결 건조하였다. 덩굴별꽃 추출물(Silene baccifera ethanol extract, SB-EE)은 dimethyl sulfoxide (DMSO; Sigma-Aldrich, USA)에 녹여 실험에 사용하였다.
2. 세포배양
HaCaT 세포는 10% fetal bovine serum (FBS; Gibco BRL, USA) 이 포함된 Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM; Gibco, USA) 배지에 1%의 penicillin-streptomycin (LONZA, Switzerland)을 첨가하여 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다.
3. 활성 산소종 분석(ROS generation assay)
활성산소종(ROS) 수준을 정량적으로 분석하기 위해 2′,7′-dichlo rodihydrofluorescein diacetate (H2DCFDA) 를 활용하여 ROS 생성량을 측정하였다. HaCaT 세포를 12-well plate에 well 당 1.5×105개의 밀도로 분주한 후, 24시간 동안 배양하였다. 이후 50 μg/mL, 100 μg/mL, 200 μg/mL 농도의 시료와 H2O2 (250 μM)를 처리하여 37℃, 5% CO2 조건의 인큐베이터에서 추가로 24시간 동안 배양하였다. 배양이 끝난 세포는 대사 속도를 늦추기 위해 차가운 인산염 완충 식염수(cold PBS)로 2회 세척 후, 10 μM H2DCFDA (Sigma-Aldrich, USA)염색 시약을 사용하여 15 min 동안 빛이 차단된 공간에서 염색하였다. 염색 후 세포는 4% formaldehyde에 20 min 동안 고정한 후, 인산염 완충식염수(PBS)로 2회 세척하고, DAPI (1 μg/mL)로 20 min 동안 염색하였다. 최종 염색이 완료된 시료는 형광 현미경(Nikon Eclipse Ti, Japan)을 이용하여 관찰하였다
4. 유세포 산소종 분석(flow cytometry-ROS generation assay)
세포 내 활성산소종(ROS) 수준을 정량적으로 분석하기 위해 유세포 분석(flow cytometry)을 수행하였다. HaCaT 세포를 12-well plate에 well 당 4×104개의 밀도로 분주하고 24시간 동안 배양하였다. 이후 50 μg/mL, 100 μg/mL, 200 μg/mL 농도의 시료 와 H2O2 (250 μM)를 처리하여 37℃, 5% CO2 조건의 인큐베이터에서 24시간 동안 배양하였다. 배양 종료 후, 세포의 대사 속도를 늦추기 위해 차가운 인산염 완충 식염수(cold PBS)로 2회 세척하였다. 세포 스크레이퍼(cell scraper)를 이용하여 세포를 수집하고 원심분리하여 상층액을 제거하였다. 세포 펠릿에 20 μM의 H2DCFDA 를 첨가하여 재현탁하여 37℃ 인큐베이터에서 배양하였다. 염색 및 배양 후, Beckman CytoFLEX 유세포 분석기(Beckman Coulter, USA)를 사용하여 세포 내 형광 강도를 측정하였다(파장 485 nm/535 nm). 측정된 형광 강도는 세포 내 ROS 수준을 반영하였다.
5. 세포 용해(cell lysis) 및 cDNA 합성
HaCaT 세포를 6-well plate에 well 당 4×105개의 밀도로 분주하고 24시간 동안 배양하였다. 이후, 명시된 농도(50-200 μg/mL)의 시료 및 H2O2 (250 μM)를 처리하여 37℃, 5% CO2 조건의 인큐베이터에서 추가로 24시간 동안 배양하였다. 배양 종료 후, 배지를 제거하고 각 well에 Trizol 용해 완충액(trizol lysis buffer, Molecular Research Center, Inc., USA) 300 μL를 첨가하여 세포를 용해시켰다. 용해액을 얼음(ice) 위에서 10 min 간 정치시킨 후, 마이크로튜브(e-tube)로 옮겼다. 각 튜브에 1-Bromo-3-chloropropane (BCP; Sigma-Aldrich) 30 μL를 첨가하고 약 15 s간 볼텍싱(vortexing)한 뒤, 다시 얼음 위에서 5 min 간 정치하였다. 혼합물을 4℃, 12,000 rpm에서 15 min간 원심분리하여 상분리를 유도하였으며, 상층액(수용액 층) 120 μL를 새로운 마이크로튜브로 조심스럽게 옮겼다. 옮겨진 상층액에 동량의 이소프로필 알코올(isopropyl alcohol) 120 μL를 첨가하고 부드럽게 혼합한 후, 상온에서 10 min 간 정치하여 RNA를 침전시켰다. 이후 4℃, 12,000 rpm에서 8 min간 원심분리하여 RNA 펠릿(pellet)을 얻었다. 상층액을 제거하고, 75% 에탄올(ethanol)을 이용하여 RNA 펠릿을 세척하였다. 세척 후 4℃, 12,000 rpm에서 5 min간 원심분리하고 남은 에탄올을 완전히 제거한 뒤, 펠릿을 상온에서 건조하였다. 건조된 RNA 펠릿은 RNase-free water에 용해시킨 후, 마이크로플레이트 리더(multi reader)를 이용하여 RNA 농도를 측정하였다. 최종적으로, 정량된 RNA를 주형으로 사용하여 Thermo Fisher Scientific 사의 cDNA 합성 키트(cDNA synthesis kit) 제조사의 지침에 따라 complementary DNA (cDNA)를 합성하였다.
6. 유전자 발현 분석(RT-PCR)
합성된 cDNA를 주형으로 사용하여 유전자 발현 분석을 수행하였다. PCR 증폭은 PCR pre-mix (Bio-D Inc., Korea)를 사용하여 수행하였으며, 반응 혼합물은 각 실험군의 cDNA, 표적 유전자(Target genes)의 전사방향(sense), 반대방향(antisense) 프라이머 및 내부 대조군(internal control) GAPDH의 프라이머를 250 μM dNTPs, 10 mM Tris-HCl (pH 8.3), 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2가 포함되도록 조성하였다 (Table 1). PCR 조건은 다음과 같이 설정하였다: 95℃에서 10 s간 초기 변성(initial denaturation), 이후 각 표적 유전자의 프라이머 결합(annealing) 온도에서 15 s간 결합, 72℃에서 1 min간 신장(extension) 단계를 총 25회 반복하였다. 증폭된 PCR 산물은 1% 아가로스 겔(agarose gel)을 이용하여 전기영동으로 분리하였다. 분리된 DNA 밴드는 MiNIBIS 이미지 분석 시스템(DNR Bio-Imaging Systems Ltd.)을 이용해 촬영하였으며, 밴드 강도는 ImageJ 소프트웨어(National Institutes of Health, USA)를 이용하여 3회 반복 측정하였으며, GAPDH 밴드를 기준으로 하여 정량화하였다. 정량화 한 픽셀 값은 평균을 내어 그래프로 나타내었다.
7. 단백질 발현 분석(Western blot)
HaCaT 세포(2×106 cells/well)를 60 mm 세포배양접시에 배양하고 H2O2 및 농도별 시료(50-200 μg/mL)를 처리하여 24시간 배양하였다. 세포를 수확하여 RIPA buffer로 용해하여 단백질을 추출하였다. Bradford solution으로 단백질을 정량한 후, 5X sample buffer를 첨가하고 90℃에서 5 min간 가열하였다. 10% SDS-polyacrylamide gel 전기영동으로 단백질을 분리하고 PVDF 멤브레인으로 전이시켰다. 3% BSA 용액으로 blocking하고, TBST로 세척 후 1차 항체(1:2500 희석)와 4℃에서 6시간 반응시켰다. TBST 세척 후 2차 항체(1:2000 희석)와 실온에서 2시간 반응시켰다. TBST 세척 후 ECL 시약을 사용하여 화학발광반응을 분석하였다. 밴드 강도는 ImageJ 소프트웨어 이용하여 3회 반복 측정하였으며, β-actin 밴드를 기준으로 하여 정량화하였다. 정량화 한 픽셀 값은 평균을 내어 그래프로 나타내었다. 본 실험에 사용된 1차(MMP-1 #54376, MMP-9 #13667, HO-1 #43966, NRF2 #12721, β-Actin #4967) 및 2차 (Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody #7074) 항체는 모두 Cell Signaling Technology (Beverly, USA)에서 구입하였다.
Results & Discussion
덩굴별꽃 추출물이 산화 스트레스에 의해 유발되는 세포 내 활성 산소종(ROS) 생성을 억제하는 효과를 분석하였다(Figure 1A, B). 추출물은 이전 연구(Kim & Kim, 2025)에서 라디칼소거능이 확인되었으며, 200 μg/mL에서 최대 효과를 나타내었고 세포 독성 또한 관찰되지 않았다. 이에 따라 본 실험에서는 50, 100, 200 μg/mL의 농도와 H2O2와 함께 처리하여 직접적인 ROS 생성 억제 효과 및 메커니즘을 H2DCFDA 염색을 통해 농도 의존적으로 평가하였다. 산화 스트레스 유도를 위해 H2O2를 단독 처리한 군에서는 H2DCFDA의 산화로 인해 세포 내에 매우 강한 녹색 형광 신호가 나타났으며, 이는 높은 수준의 ROS 생성을 나타낸다. 반면, 덩굴별꽃 추출물을 50, 100, 200 μg/mL 농도로 H2O2와 함께 처리한 군에서는 추출물 농도가 증가함에 따라 형광 신호 강도가 농도 의존적으로 감소하였으며, 특히 고농도 처리군에서 ROS에 의한 형광이 뚜렷하게 감소하였다. 현광 현미경 이미지에서는 파란색 DAPI 형광으로 핵이 명확히 확인되었고, merge 이미지를 통해 녹색 ROS 신호가 세포 전체에 분포하고 있음을 볼 수 있으며, 덩굴별꽃 추출물 처리군에서는 녹색 신호가 핵과 세포질 모두에서 뚜렷하게 감소하였다(Figure 1A). 유세포 분석에서는 이러한 경향이 정량적으로 확인되어, 추출물 농도가 증가할수록 세포 내 ROS 생성 수준이 감소함을 보여주었다(Figure 1B). 추가적으로 해당 형광 값은 DAPI 염색을 통해 세포 수를 기준으로 정규화하였다(Figure 2). 세포 집단 전체의 ROS 수준 변화를 정량적으로 평가하기 위해 유세포 분석을 수행하였다. 음성대조군(H2O2/SB-EE 무처리군)에서는 ROS 양성 세포가 8.00%로 낮게 나타났으나, H2O2를 처리한 세포군은 ROS 양성 세포가 60.84%로 급격하게 증가함을 확인하였다. 이는 H2O2가 HaCaT 세포 내 산화 스트레스를 효과적으로 유도함을 의미한다. 그러나 덩굴별꽃 추출물을 H2O2와 함께 처리하였을 때 50 μg/mL 농도에서 ROS 양성 세포가 40.74%로 감소하였고, 100 μg/mL와 200 μg/mL 농도에서 각각 24.46%와 11.18%로 ROS 양성 세포가 감소하였다. 특히 200 μg/mL 농도에서는 ROS 양성 세포가 음성대조군에 유사한 수준으로 감소함을 확인하였다. 이 결과는 덩굴별꽃 추출물이 산화 스트레스를 효과적으로 완화시킬 수 있는 우수한 항산화 활성을 지니고 있음을 의미한다. 이와 유사하게 이전 연구에서 Mentha suaveolens 추출물 또한 H2O2로 유도된 HaCaT 세포의 산화적 손상을 억제하고, NRF2 및 항산화 효소(HO-1, NQO-1)의 발현을 증가시킴으로써 세포 보호 효과를 나타낸 바 있다(Lee et al., 2019). 이는 본 연구와 동일한 세포주와 산화 스트레스 유도 모델을 사용한 사례로서, 식물 유래 소재가 NRF2 신호 경로를 통해 항산화 효과를 유도할 수 있음을 뒷받침한다. 또한, Scutellaria baicalensis 추출물 역시 DCFH-DA 기반 유세포 분석을 통해 H2O2 유래 ROS 억제 효과를 입증하였으며(Zheng et al., 2025), 이와 같은 선행 연구들은 본 실험에서의 항산화 효능 분석의 적용과 결과의 신뢰성을 뒷받침할 수 있다.
덩굴별꽃 추출물이 산화 스트레스 조건 하에서 항산화 및 피부 노화 관련 유전자 발현에 미치는 영향을 RT-PCR을 통해 분석하였다. 항산화 신호전달 경로의 핵심 조절인자인 NRF2 및 HO-1, SOD1, NQO1의 mRNA 발현 변화를 분석한 결과, H2O2 단독 처리군에 비해 덩굴별꽃 추출물을 100 μg/mL와 200 μg/mL 농도로 처리한 군에서 해당 유전자들의 mRNA 발현이 증가하였다(Figure 3A). 이는 덩굴별꽃 추출물이 NRF2 신호전달 경로를 활성화하여 세포의 항산화 방어 기전을 강화할 수 있음을 시사한다. H2O2 단독 처리군에서도 대조군에 비해 NRF2와 항산화 유전자의 발현이 다소 증가하는 경향을 확인할 수 있었다. H2O2가 세포 내 산화 스트레스 반응의 일환으로 NRF2 및 항산화 효소 유전자의 발현을 증가시키며, 이는 세포가 산화 스트레스에 대응하여 NRF2 경로를 활성화하는 자연스러운 방어 기전으로 해석된다. 이러한 결과는 HaCaT 세포를 대상으로 한 Choi (2019)와 Kundu et al. (2014)의 연구에서도 유사하게 관찰되었다.
NRF2는 산화 스트레스 감지 시 핵으로 이동하여 항산화 반응 요소(antioxidant response element, ARE)와 결합하고, HO-1, NQO1, SOD1 등 항산화 효소 유전자의 전사를 촉진하는 대표적인 전사조절인자이다(Eibulayin et al., 2024). 선행연구에서도 NRF2 경로의 활성화는 다양한 식물 유래 항산화 소재에서 공통적으로 관찰되어 왔으며, 이는 세포 보호 및 피부 노화 지연에 중요한 생물학적 기전으로 보고되고 있다(Zhou et al., 2020).
피부 노화 및 세포외기질 분해에 관여하는 MMP1, MMP9와 콜라겐 합성과 관련된 Col1a1 유전자의 발현 변화를 분석한 결과, H2O2 단독 처리군은 MMP1 및 MMP9의 mRNA 발현이 증가하였고 반대로 Col1a1의 mRNA 발현이 감소하였다. 그러나 덩굴별꽃 추출물을 100 μg/mL와 200 μg/mL 농도로 처리한 결과, H2O2에 의해 증가된 MMP1 및 MMP9 mRNA 발현이 감소하였다. 또한 콜라겐 합성에 중요한 Col1a1 mRNA 발현은 덩굴별꽃 추출물 처리 농도에 비례하여 증가하였다(Figure 3B). 이러한 결과는 덩굴별꽃 추출물이 MMP 유전자 발현을 억제하고 콜라겐 합성을 촉진함으로써 피부 노화 방지에 긍정적인 영향을 줄 수 있음을 나타낸다. 이 연구 결과와 유사한 경향은 여러 식물 유래 항노화 소재 연구에서도 보고된 바 있다. Camellia sinensis 추출물과 Scutellaria baicalensis 추출물은 각각 MMP 유전자의 발현 억제와 콜라겐 유전자 발현 촉진을 통해 항노화 효과를 보였다(Goh et al., 2025). 덩굴별꽃 추출물 또한 이와 유사한 기전을 통해 산화 스트레스 유발성 피부 노화 억제 기능을 가질 수 있음을 확인하였으며, 기능성 화장품 소재로의 활용이 가능할 것으로 예측된다.
유전자 수준에서의 결과가 단백질 수준에서도 확인되는지 검증하기 위해 Western blot 분석을 수행하였다(Figure 4). 산화 스트레스 조건 하에서 덩굴별꽃 추출물 처리군(50, 100, 200 μg/mL)과 H2O2 단독 처리군을 비교하여 항산화 신호전달 관련 단백질(NRF2, HO-1) 및 피부 노화 관련 단백질(MMP1, MMP9)의 발현 변화를 분석하였다. RT-PCR 결과와 같이 덩굴별꽃 추출물에서 주요 항산화 단백질인 NRF2 및 HO-1의 발현이 농도 의존적으로 유의하게 증가하였다. 이는 덩굴별꽃 추출물이 NRF2 신호전달 경로를 활성화하여 항산화 효소 발현을 단백질 수준에서도 증가함을 확인한 결과이다. 피부 노화 관련 단백질인 발현을 분석한 결과, H2O2 단독 처리군에서는 MMP1 및 MMP9 단백질 발현을 증가시켰으나, 덩굴별꽃 추출물을 50, 100, 200 μg/mL 농도로 처리한 결과, 이들 단백질의 발현이 감소하였다. 이 결과는 덩굴별꽃 추출물이 산화적 스트레스에 의해 유도되는 MMP 단백질 발현을 효과적으로 억제함을 나타낸다.
종합적으로, 유전자 및 단백질 발현 분석 결과는 덩굴별꽃 추출물이 NRF2-매개 항산화 신호전달 경로를 활성화하여 세포의 항산화 방어능을 강화하는 동시에, MMP 유전자 및 단백질 발현을 억제하고 Col1a1 유전자 발현을 증가시킴으로써 피부 노화 과정을 억제할 수 있음을 의미한다.
Conclusion
이 연구에서는 덩굴별꽃추출물이 산화 스트레스 조건 하에서 HaCaT세포에서 항산화 방어력 및 피부 노화 관련 유전자 및 단백질 발현 조절에 미치는 효과를 평가하였다. 결론적으로 덩굴별꽃(Silene baccifera) 추출물이 H2O2에 의해 유도된 ROS 생성을 억제하고, 최대 농도인 200 μg/mL 농도에서는 ROS 양성 세포의 비율이 음성대조군 수준까지 회복되어 우수한 항산화 활성을 보였다. 또한, RT-PCR 분석 결과, 덩굴별꽃 추출물은 항산화 신호전달 경로의 핵심 전사조절인자인 NRF2, HO-1, SOD1, NQO1의 mRNA 발현을 유의하게 증가시켰으며, 피부 노화 관련 MMP1, MMP9의 발현은 억제하고 콜라겐 합성 관련 Col1a1 유전자 발현이 증가하였다. Western blot 분석 결과, 역시 NRF2, HO-1 발현이 증가하였으며, MMP1와 MMP9 단백질 발현이 감소함을 확인하였다. 즉, 덩굴별꽃 추출물이 NRF2 매개 항산화 신호전달 경로를 활성화하고, MMP 억제 및 콜라겐 합성 촉진을 통해 피부 노화를 완화할 수 있는 생물학적 기반을 제시하였다. 이는 덩굴별꽃 추출물이 항산화 및 항노화 기능성 화장품 소재로서의 활용을 뒷받침하는 결과이다.
다만, 이 실험에서는 HaCaT 세포를 이용한 in vitro 조건에서만 수행되었으며, 이는 실제 생체 내 피부 환경을 완벽히 반영하지 못할 수 있다. 향후에는 임상시험을 통해 유효성과 안전성을 검증하고, 실질적인 피부 적용 가능성을 평가할 필요가 있다.
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