감잎(Diospyros kaki Thunb. leaf)은 서울 경동시장(Korea)에서 구입하였고, 증류수 2,000 mL와 감잎 200 g을 round flask에 넣고 100℃에서 2 h 동안 가열 추출한 후, 진공회전 농축기(EYELA N-2100; Tokyo Rikakikai, Japan)로 감압 농축하였다. 이후 동결 건조기로 건조하여 얻은 38.90 g (건조중량 대비 수득율: 19.45%)의 분말을 실험에 사용하였다.

NHEKs와 세포배양을 위한 배지인 KGM-gold bulletKit은 Lonza (Switzerland)에서 구입하여 사용하였다. NHEKs는 37℃, 5% CO₂, 습도 100%의 세포배양기에서 배양하였다.

DPPH 라디컬(Sigma-Aldrich, USA) 소거능 분석을 위해 DPPH를 methanol:water (3:2)에 0.1 mM로 녹여 사용하였다. DPPH 용액 500 μL에 시료 50 μL를 넣고 실온에서 20 min 동안 반응시킨 후 microplate spectrophotometer (Epoch; BioTek Instruments, USA)로 517 nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다. 양성대조군으로는 ascorbic acid (Sigma-Aldrich)를 사용하였다. DPPH 라디컬 소거능은 시료무첨가군과 시료첨가군 사이의 흡광도 차이를 백분율로 나타내었다.

DPPH 라디컬 소거능(%)=100–{(시료첨가군의 흡광도/시료무첨가군의 흡광도)×100}

UVA 조사로 인한 NHEKs의 노화를 확인하기 위해서 하기와 같은 조건으로 UVA를 처리하였다. NHEKs가 배양되고 있는 35 mm 배양접시에 Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM, without phenol red; Welgene, Korea)을 접종한 후, 자외선 조사기(Bio-Link; Vilber Lourmat, Germany)를 사용하여 3 J/cm²의 UVA를 조사하였다.

세포 생존율은 cell counting kit-8 (CCK-8; DoGenBio, Korea) 분석법을 이용하였다. NHEKs (3×10³ cells/well)를 배양접시에 접종한 후 감잎 추출물을 농도 별로 24 h 처리하고 CCK-8 시약을 DMEM에 1/10로 희석하여 첨가한 후 1 h 동안 세포배양기에서 배양하였다. 배양액은 450 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 세포를 배양하지 않은 배지만 넣은 대조군의 흡광도로 보정하여 세포 생존율을 산출하였다.

TRIzol reagent (Invitrogen^™, Thermo Fisher Scientific, USA)를 사용하여 RNA를 추출하였다. ReverTra Ace^® reverse transcription kit (Toyobo, Japan)를 이용하여 RNA로부터 cDNA를 합성하였으며, NHEKs 표지인자 발현양상을 비교하기 위하여 real-time PCR (StepOnePlus Real-Time PCR System; Thermo Fisher Scientific)을 진행하였다. 실험에 사용된 특정 TaqMan^® Gene Expression Assay (Thermo Fisher Scientific)는 Table 1과 같다.

감잎 열수 추출물에 의한 히알루론산 생성 정도를 알아보기 위하여 NHEKs를 24 h 동안 37℃ CO₂ 배양기에서 배양한 후, 3 J/cm²의 UVA를 조사하였다. 자외선 조사 후 감잎 열수 추출물을 첨가하여 세포배양기에서 48 h 동안 배양하였다. 배양액 내의 히알루론산 단백질의 양은 Hyaluronic Acid (HA) Test Kit (Corgenix, USA)를 이용하여 측정하였다.

본 실험에서의 통계처리는 Student’s t-test법을 이용해 유의 수준 0.05 (p<0.05)로 하여 검정하였다.

활성산소종의 과도한 생성은 노화나 암 등의 질환을 유발하며, 활성산소종은 피부 광노화에 있어 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다(Pryor, 1982). 항산화제의 라디컬 소거능을 평가하는데 일반적으로 사용되는 DPPH는 비교적 안정한 라디컬로서 전자를 공여 받게 되면 자체의 자색이 엷어진다. 본 연구에서 감잎 열수 추출물을 10 mg/mL에서 10 ng/mL의 농도로 연속 희석하여 라디컬 소거능을 측정한 결과, 농도 의존적으로 DPPH 라디컬 소거능이 증가하였으며, 특별히 10 mg/mL과 1 mg/mL의 감잎 추출물 처리시 양성대조군으로 사용한 ascorbic acid와 유사한 항산화 효과를 지님을 확인하였다(Figure 1). 감잎은 플라보노이드 배당체, 페놀류, 탄닌, 커큐민류, 비타민 C 등과 같은 다양한 항산화 물질과 다당체, 환원당, 유기산, 엽록소 등이 함유되어 있는 소재로 다류 등으로 사용되는 식물로 알려져 있다(Joung et al., 1995; Son & Kim, 2011). 따라서, 본 연구 결과는 감잎에 함유된 풍부한 항산화 물질에 의해 항산화 효과가 나타났다는 Lee (2014)의 보고와 일치하였다.

NHEKs에 대한 감잎 열수 추출물의 세포독성을 확인하기 위하여 CCK-8 assay를 수행하였다. 대조군은 시료를 처리하지 않았고 감잎 열수 추출물은 1, 10, 100 ng/mL ,1, 10, 100, 1,000 μg/mL의 농도 순으로 처리하여 세포 생존율을 측정하였다(Figure 2A). 감잎 열수 추출물을 1 μg/mL 농도 이상 처리할 때 NHEKs의 생존율이 유의성 있게 감소하여, 추가적으로 1 μg/mL과 10 ng/mL 사이의 농도를 세분화하여 CCK-8 assay를 실시하였다(Figure 2B). 500 ng/mL의 농도에서 NHEKs의 생존율이 대조군과 유사함을 확인하여 본 실험에서는 500, 200, 100 ng/mL의 감잎 열수 추출물을 처리하여 추가실험을 수행하였다.

NHEKs에 UVA (3 J/cm²)를 조사한 후, 감잎 열수 추출물을 24 h 처리하여 NHEKs가 발현하는 보습인자인 AQP3와 HAS2의 발현 양을 real-time PCR법을 통하여 확인하였다. AQP3와 HAS2는 인간각질형성세포에서 발현되는 유전자로 보습에 관여하는 표지인자로 알려져 있다(Park & Shim, 2016). 자외선 조사에 의해 AQP3, HAS2의 발현이 감소하였으나, 200 ng/mL의 감잎 열수 추출물 처리군에서 자외선 조사군 대비 AQP3의 발현이 2.3배(Figure 3A), HAS2의 발현이 2.4배(Figure 3B) 증가하는 효과를 보였다. 세포 외부의 수분을 세포 내로 수송하는 기능을 담당하는 AQP3과 히알루론산을 생성하는 효소인 HAS2의 mRNA 발현을 증가시키는 결과를 바탕으로, 감잎 열수 추출물이 피부보습에 긍정적인 기능이 있는 것으로 사료된다(Hara-Chikuma & Verkman, 2008; Hašová et al., 2011; Sougrat et al., 2002).

HAS2는 인간각질형성세포에서 히알루론산을 생합성 하는데 중요한 역할을 하는 효소로 알려져 있다(Karvinen et al., 2003; Kim et al., 2004). 감잎 열수 추출물을 처리하여 HAS2 mRNA의 발현량이 증가된 NHEKs에서 히알루론산 단백질의 생성 역시 증가되는지를 알아보기 위해 히알루론산에 대한 효소결합 면역흡착법을 사용하여 측정하였다(Figure 4). 실험결과, UVA 조사에 의해 40% 가량 생성이 감소되었던 히알루론산이 감잎 열수 추출물 처리에 의해 자외선 조사군 대비 53% 가량 증가함을 확인하였다. 이 결과는 실시간 유전자 중합효소 연쇄반응의 HAS2 mRNA에 대한 실험 결과와 일관성이 있으며, 감잎 열수 추출물은 HAS2 mRNA의 발현뿐 아니라 유전자 발현에 의한 산물인 히알루론산 단백질의 생성 역시 증가시킬 수 있음을 시사한다.

인간각질형성세포는 기저층에서 각질층으로 분화되면서 각질화되어 탈락되는 각질턴오버를 거친다. 기저층의 각질형성세포가 유극층, 과립층, 각질층으로 분화가 되면서 KRT5, KRT14 등의 표지인자의 발현은 감소하고 FLG, LOR, KRT1, KRT10과 같은 단백질 발현은 증가한다고 알려져 있다(Eckert et al., 2005). 따라서 기저층의 각질형성세포 표지인자로 KRT5와 KRT14 등의 단백질이 표지인자로 사용되고, 과립층 및 유극층의 각질형성세포는 FLG, LOR, KRT1, KRT10 등의 단백질이 표지인자로 활용된다. 표피층이 자외선과 같은 외인성 노화를 유도하는 스트레스를 받게 되면 각질형성세포의 분화가 촉진되어 과각질화가 유도된다. 본 실험에서는 NHEKs에 UVA를 조사하여 과각질화를 유도한 상태에서 감잎 열수 추출물을 처리했을 때, 분화된 각질형성세포의 표지인자인 FLG, LOR, KRT1, KRT10의 발현을 real-time PCR법으로 확인하였다. 위의 4가지 표지인자 중 자외선에 의해 FLG, KRT1, KRT10의 발현이 현저하게 증가하였고 LOR의 발현에는 큰 영향을 끼치지 않았다(Park & Shim, 2016). FLG (Figure 5A)와 LOR (Figure 5B)은 감잎 열수 추출물에 의해 특이적인 발현의 차이는 보이지 않은 반면, KRT1의 경우 감잎 열수 추출물 처리시 KRT1의 발현이 자외선 처리군 대비 85% 감소하고(Figure 5C), KRT10의 경우에는 500 ng/mL과 200 ng/mL의 농도에서 58% 가량 감소함을 확인할 수 있다(Figure 5D). 이는 자외선이 각질형성세포의 과각질화를 유발하지만, 감잎 열수 추출물이 KRT1과 KRT10의 발현을 감소시켜 과도한 분화를 억제시킬 수 있음을 보여준다.