주름뼈대그물말에 의한 RAW264.7 세포에서의 항염효과
Anti-inflammatory Effect of Dictyopteis undulata in RAW 264.7 Cells
波状网翼藻对RAW 264.7细胞的抗炎作用
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Abstract
목적
본 연구는 주름뼈대그물말에 의한 RAW264.7 세포의 항염효과를 확인하기 위하여 수행되었다.
방법
주름뼈대그물말이 RAW264.7 세포에 항염효과를 보이는지 확인하기 위하여, 주름뼈대그물말 추출물에 의한 세포생존률 측정, 인터류킨류와 TNF-a의 유전자 발현 분석, 산화질소와 PGE2</sub의 생성을 확인하였다.
결과
본 연구를 통해 주름뼈대그물말 추출물이 인터류킨류와 TNF-a의 유전자 발현을 감소시켰다. 또한 PGE2</sub와 산화질소의 생성을 감소시켰다.
결론
본 연구를 통해 주름뼈대그물말 추출물의 항염효과를 확인하였고, 코스메슈티컬 및 제약 등의 산업 등에도 응용될 수 있을 것으로 여겨지며 그 기능을 확인하기 위해 추가적인 기전연구가 필요할 것으로 보인다.
Trans Abstract
Purpose
This study aimed to analyze the anti-inflammatory effects of Dictyopteris undulata extract on skin using RAW 264.7 cells.
Methods
Its anti-inflammatory effects on RAW 264.7 cells were evaluated by measuring the cell viability, gene expression levels (IL-1α/IL-1β/IL-6 and TNF-α), and nitric oxide (NO)/prostaglandin E2 (PGE2) production.
Results
Quantitative real-time polymerase chain reaction showed that the D. undulata extract decreased the mRNA levels of IL-1α/IL-1β/IL-6 and TNF-α. Additionally, PGE2/NO detection revealed that D. undulata extract exhibited anti-inflammatory properties.
Conclusion
D. undulata extract is a potential anti-inflammatory compound. Further study on the anti-inflammatory mechanisms of D. undulata extract would facilitate the development of cosmeceutics and pharmacological treatments.
Trans Abstract
目的
使用 RAW 264.7 细胞分析波状网翼藻(D.undulata)提取物对皮肤的抗炎作用。
方法
通过测量细胞活力、 基因表达水平(IL-1α /IL-1β /IL-6 和TNF-α) ,一氧化氮(NO)以及PGE2</sub来评估其对RAW 264.7细胞的抗炎作用。
结果
实时定量聚合酶链反应显示,D.undulata 提取物降低了IL-1α /IL-1β /IL-6 和TNF-α 的mRNA 水平。此外, PGE2</sub/NO检测表明D. undulata 提取物具有抗炎特性。
结论
D.undulata 提取物是一种潜在的抗炎化合物。对 D.undulata 提取物抗炎机制的进一步研究将有助于药妆品和药物治疗的发展。
Introduction
염증(inflammation)은 박테리아, 외부 자극원 혹은 사멸하는 세포 등을 포함한 자극에 대한 면역 반응으로 알려져 있다(Albina & Reichner, 1995). 염증은 생체 조직과 세포를 보호하기 위한 면역반응이지만, 과도하게 되면 신경 퇴행성 장애, 고혈압, 당뇨병, 아테로마성 동맥경화증, 암 등과 같은 질환을 유발해 세포 및 조직을 손상시킬 수 있다(Albina & Reichner, 1995).
세균 세포벽의 구성성분인 lipopolysaccharide (LPS)는 대식세포(macrophage) 세포막에 존재하는 Toll-like receptor (TLR)에 결합하여 대식세포 내부 신호전달체계인 mitogen-activated protein kinase (MAPK), nuclear factor kappa beta (NF-ĸB) 신호를 활성화시킨다. 이를 통해 대식세포는 산화질소(nitric oxide, NO)와 프로스타글란딘(prostaglandin E2, PGE2) 등의 염증매개인자를 분비하고, 염증성 싸이토카인인 interleukin-1α/β, (IL-1α/β), IL-6, tumor necrosis factor-α (TNF-α) 등의 생성을 증가시킨다(Akira & Takeda, 2004; Gomez et al., 2005). 특별히 대식세포는 면역학적 과정에 중요한 역할을 하는 세포로써 항원 제시, 식균 작용, 면역조절 등의 기능을 담당하고 이를 위해 염증매개인자 및 싸이토카인을 분비한다(Akira & Takeda, 2004; Gomez et al., 2005). 이렇게 생성된 염증매개인자와 싸이토카인은 면역기능을 강화시키고 주변세포를 보호하는 역할을 하나, 과도하게 생성된 NO와 PGE2 등은 염증을 유발하기도 한다(Kim et al., 2004). 일반적으로 NO는 외부에서 침입한 박테리아 등을 죽이는 역할을 하거나 종양을 억제하지만 과도하게 생성된 NO는 주변 세포들의 유전자 변이, 신경손상 등과 같은 조직손상 등을 유발한다(Gabay, 2006; van Triel et al., 2010; Im, 2014). 대식세포가 LPS에 의해 자극을 받게 되면 NO와 PGE2의 생성이 증가되고 이는 염증성 싸이토카인인 IL-1, 6 및 TNF-α 등을 생산한다(Hirohashi & Morrison, 1996; Horwood et al., 2006). 따라서 NO, PGE2, 그리고 염증성 싸이토카인 등의 생성을 억제하는 것은 염증에 의해 발생하는 질환의 예방과 치료에 중요한 목표가 된다.
주름뼈대그물말(Dictyopteris undulata, D. undulata)은 우리나라 전 연안의 조간대와 조하 암반에 주로 부착하여 서식하며 연중 출연하지만 특히 여름에 쉽게 관찰되는 해조류로 알려져 있다. 주름뼈대그물말에 함유되어 있는 세스퀴테르페노이드(sesquiterpenoids)가 항산화효과가 있다는 보고와 항암, Nrf2/ARE 신호전달체계를 경유하여 신경을 보호하는 등의 효과가 있다고 보고된 바 있다(Kang et al., 2014; Shimizu et al., 2015; Kumagai et al., 2018).
하지만 D. undulata이 RAW 264.7 세포주에서 염증에 효과가 있는지에 대한 연구는 보고된 바가 없다. 따라서 본 연구를 통해 LPS에 의해 자극이 유도된 RAW264.7 세포주에 D. undulata를 처리하였을 때의 항염증 효과를 확인하였다. D. undulata에 의한 RAW 264.7 세포주의 생존율과 대식세포가 발현하는 표지인자 및 NO와 PGE2의 발현 등을 CCK-8 assay, real-time RT-PCR 및 ELISA로 각각 분석하였다.
Methods
1. 실험재료 및 RAW 264.7 세포주 배양
본 실험에 사용된 주름뼈대그물말(D. undulata)은 2017년 7월 26일에 제주특별자치도 서귀포시의 근해에서 채집된 시료이며, 국립해양생물자원관의 해양바이오뱅크로부터 분양받아 사용하였다. 주름뼈대그물말(MABIK NP30200011)은 전 부위를 동결건조한 후 20 g의 시료를 70% EtOH (200 mL)을 용매로 하여 1 h씩 3회 소니케이션 (WUC N30H; Daihan Science, Korea)하여 추출하였고, 에탄올:DMSO (1:1; vol/vol)을 용매로 하여 10 mg/mL의 농도로 용해시켜 실험에 사용하였다.
한국세포주은행에서 RAW 264.7 대식세포주를 분양받아 사용하였다. 우태아혈청(fetal bovine serum, FBS; Welgene, Korea) 10% 와 항생제인 penicillin/streptomycin (Thermo Fisher, USA)이 1% 첨가된 DMEM (Welgene, Korea)을 배양배지로 사용했다. RAW 264.7 대식세포주는 CO2 인큐베이터(37℃, 5% CO2, 100% 습윤조건)에서 배양하였다.
2. 세포 생존율 검증
D. undulata 추출물에 대한 세포생존율 분석은 CCK-8 (Cell Counting Kit-8; EZ-Cytox, DoGen, Korea)를 사용하여 측정하였다(Shim, 2022; Shim, 2023). RAW 264.7 대식세포주를 24 well 조직 배양 접시에 2.4×104개로 접종하고 24 h 동안 인큐베이터에서 선배양한 후, D. undulata 추출물을 FBS가 첨가되지 않은 DMEM에 농도 별로 희석하여 24 h 처리하였다. 이후 phenol-red와 FBS가 첨가되지 않은 DMEM에 CCK-8 solution을 1/10로 희석하여 1 h 동안 반응시켰다. Microplate reader (450 nm; Epoch, BioTek, USA)를 사용하여 흡광도를 측정하였고, 세포가 없는 배지의 흡광도를 blank 로 하여 백분율로 표시하였다.
3. 실시간 유전자 중합효소 연쇄반응(Real-time quantitative RT-PCR, qRT-PCR)
Lugen Sci Co의 Sensi-TriJolTM Reagent (Korea)를 사용하여 세포의 total RNA를 추출하였다. SuperiorScriptTM III reverse-transcriptase (Enzynomics, Korea)을 사용하여 cDNA를 합성하였고, 유전자의 발현양상을 확인하기 위하여 LightCycler® 96 real-time PCR machine (Roche, Germany)을 이용하여 qRT-PCR 실험을 수행하였다. 실험에 사용된 Taqman® Gene expression assay (Applied Biosystems, USA)는 Table 1에 명기하였다.
4. Nitric oxide (NO) 정량
RAW 264.7 대식세포주를 35 mm 조직 배양 접시에 1.2×105 cells로 접종하고 24 h 동안 인큐베이터에서 안정화 시키고, lipopolysaccharide (LPS; Sigma, USA) 100 ng/mL와 D. undulata 추출물을 FBS가 첨가된 DMEM 배지에 농도 별로 희석하여 48 h 동안 배양 후, 상층액을 모아 원심분리한 후 상등액 100 μL를 iNtRON(Korea)사의 NO detection kit로 제조사의 프로토콜을 참고하여 측정하였다. 실험방법을 간략히 요약하자면, 100 μL 의 상등액에 N1 buffer (50 μL)를 첨가하여 5 min간 상온에서 반응시킨 후 N2 buffer (50 μL)를 추가하여 10 min 간 반응시키고 520 nm 파장의 microplate reader로 흡광도를 측정하였다.
5. PGE2-ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay)
D. undulata 추출물에 의한 PGE2 호르몬의 생성에 미치는 정도를 확인하기 위해 RAW 264.7 대식세포주를 35 mm 조직 배양 접시에 1.2×105 cells로 접종하고 24 h 동안 인큐베이터에서 선배양한 후, 100 ng/mL의 LPS와 D. undulata 추출물을 농도별로 인큐베이터에서 6 h 동안 배양하였다. PGE2-ELISA kit (Invitrogen, USA)를 사용하여 제조사의 프로토콜을 참고하여 RAW 264.7 세포가 분비하는 PGE2를 정량분석하였다(Im et al., 2024).
6. 통계분석
유의성검증을 위한 통계처리는 Student’s T-test법을 이용하여 유의수준 0.05 이하 (p<0.05)로 하여 검정하였다.
Results and Discussion
1. Dictyopteris undulata 추출물의 농도별 RAW 264.7 세포주의 생존율 분석
RAW 264.7 세포주와 같은 대식세포는 생체 전반에 분포하고 있으며, LPS 등과 같은 염증 유발인자에 반응하여 면역반응을 유도하는 세포로, 다양한 싸이토카인을 분비하고 후천성 면역을 유도하는 항원제시세포로서의 역할을 하는 세포로 알려져 있다(Lawrence et al., 2002). D. undulata 추출물의 항염증 효과를 분석하기에 앞서, 실험에 적용하고자 하는 D. undulata 추출물의 독성여부를 확인하기 위해 CCK-8 assay로 RAW 264.7 세포에서의 생존율을 확인하였다. 실험대조군은 D. undulata 추출물을 처리하지 않았고, 시료처리군은 1000, 100, 10 μg/mL, 100, 10, 1 ng/mL의 농도로 처리하여 세포 생존율을 분석하였다(Figure 1). 100 μg/mL 농도 이상의 D. undulata 추출물을 처리한 실험군의 생존율이 대조군 대비 유의성 있게 감소하였고(p<0.05), 10 μg/mL 이하의 농도를 처리한 실험군에서의 생존율은 대조군의 생존율과 유사한 결과를 보였기에 본 연구에서 진행되는 추가적인 실험은 10, 1, 0.1 μg/mL의 D. undulata 추출물 농도를 선정하여 실험을 진행하였다.
2. D. undulata 추출물이 NO 생성에 미치는 영향 분석
Nitric oxide (NO)는 혈압을 조절하고, 외부에서 침입한 박테리아나 종양을 제거하고 세부적인 면역 반응을 유발하기 위한 신호전달을 매개하는 등 다양한 역할을 담당한다고 알려져 있다(Lee et al., 2014). 하지만 과도하게 생성되는 NO는 신경조직 등의 손상을 야기하고, 세포 내 유전적 변이를 유발하거나, 부종을 야기하는 등의 염증을 야기한다(Gabay, 2006; van Triel et al., 2010; Im, 2014). 본 실험에서 D. undulata 추출물에 의한 NO의 감소를 확인한 결과, LPS에 의해 21.7 μM 농도로 생성된 NO가 10 μg/mL의 D. undulata 추출물을 처리하였을 때 6.9 μM로 감소하였다. 이는 D. undulata 추출물이 LPS 처리군 대비 NO 생성량을 유의성 있게 감소시키는 것으로 나타났다(Figure 2A).
박테리아의 세포벽 성분인 LPS는 대식세포에서 NO synthase 2 (NOS2)라는 효소의 발현을 유도하고, 이 효소는 NO의 생성을 증가시킨다(Namazi, 2004). 따라서 D. undulata 추출물이 NO를 생성하는 효소인 NOS2 유전자 발현을 감소시키는지 확인하고자 qRTPCR으로 확인하였다. NOS2 유전자의 발현이 대조군에 비해 LPS 처리군에서 유의성 있게 증가하였으나, 10, 1, 0.1 μg/mL의 D. undulata 추출물을 각각 처리한 RAW 264.7 세포주에서 LPS 처리군 대비 NOS2의 발현이 유의성 있게 감소함을 확인하였다(Figure 2B).
3. D. undulata 추출물이 PGE2의 생성에 끼치는 영향
Arachidonic acid 유래의 불포화지방산인 prostaglandin (PG)는 염증반응을 유도하는 호르몬이다(Yun et al., 2008). PG의 한 종류인 PGE2는 cyclooxygenase-2 (COX-2) 효소와 prostaglandin E synthase 1, 2, 3의 순차적인 작용에 의해 아라키돈산으로부터 만들어지며 다양한 염증반응을 유발하는 인자이다(Harris et al., 2002; Namazi, 2004; Yun et al., 2008). 다양한 PG 중에서 PGE2는 포유류의 피부에서 발견되는 주요 PG으로 알려져 있기에 본 연구에서는 PGE2의 생성을 중점적으로 확인하였다(Li et al., 2015). D. undulata 추출물의 항염 효능을 확인하기 위하여 D. undulata 추출물의 PGE2 호르몬의 감소 정도를 확인한 결과, LPS 처리군에서 PGE2의 생성이 18.5 μg/mL로 증가하였다. 그에 반해 10 μg/mL의 D. undulata 추출물을 처리하였을 때에는 PGE2의 생성이 11.4 μg/mL로 나타나 LPS 처리군과 비교시 PGE2 생성이 유의성 있게 감소하였다(Figure 3A). 또한 PGE2 호르몬을 생성하는 효소인 COX-2의 발현을 확인한 결과, 대조군 대비 LPS 처리군에서 2.1배 증가하였으나 10 μg/mL의 D. undulata 추출물을 처리한 세포주에서는 LPS 처리군 대비 32% 감소하였다(Figure 3B).
4. D. undulata 추출물이 염증성 싸이토카인의 생성에 미치는 영향
피부에서 만성적인 염증은 피부질환 뿐만 아니라 피부의 노화를 야기할 수 있다(Noman et al., 2009; Shon et al., 2013; Lee et al., 2014). IL-1α와 IL-1β는 면역반응, 염증과정 및 조혈 등에 관여하는 싸이토카인으로, 대식세포 및 대식세포에 의해 면역반응이 유도된 형질세포 및 진피층의 섬유아세포 등에서 생성되는 강력한 염증 매개체이다(Lord et al., 1991; Ban et al., 2011). 특히, IL-1β는 염증부위에 림프구와 호중구 등의 염증매개세포의 침윤을 유도하는 싸이토카인으로 잘 알려져 있다(Roitt et al., 2002; Baek et al., 2012). IL-6는 형질세포가 염증매개체에 특이적으로 반응할 수 있는 성숙과 성장을 유도하고, 알러지 등을 포함한 염증성 질환을 유발한다고 알려져 있다(Gabay, 2006; Lee et al., 2014). 또한, TNF-α는 염증반응 초기에 염증부위로 호중구를 불러들여 급성 면역반응과 발열과 부종을 유발하는 인자이다(Zhang et al., 1992).
LPS는 RAW 264.7대식세포주에서 염증성 싸이토카인인 인터류킨류와 TNF-α 등의 생산을 촉진한다. 본 실험에서는 RAW 264.7 대식세포주에 LPS (100 ng/mL)를 처리하여 염증반응을 유발한 후 D. undulata 추출물에 의한 염증성 싸이토카인 감소여부를 확인하였다. IL-1α는 LPS 처리군에 의해 11.5배 증가하였으나 10 μg/mL 의 D. undulata 추출물을 처리하였을 때 LPS 처리군 대비 88% 가량 발현이 감소하였고 1 μg/mL과 0.1 μg/mL의 D. undulata 추출물을 처리한 세포군에서는 LPS에 의해 염증반응이 유발된 실험군에 비해 IL-1α 유전자의 발현이 각각 43, 29% 감소하였다(Figure 4A). IL-1β 유전자의 발현은 LPS 처리군에 의해 20.4배 증가하였으나 D. undulata 추출물의 농도별로 각각 94, 28, 17% 감소하였다(Figure 4B). IL-6는 LPS 처리군에 의해 96.1배 증가하였는데, D. undulata 추출물 농도별로 처리하였을 때 각각 97, 54, 47% 가량 발현이 감소하였다(Figure 4C). TNF-α는 10 μg/mL 농도의 D. undulata 추출물에서 LPS 처리군에 비해 34% 가량 감소하였다(Figure 4D). 본 연구에서 D. undulata 추출물이 염증에 관여하는 전사인자 중 인터류킨류와 TNF-α 의 발현을 감소키켰고, NO 및 PGE2의 생성 모두 감소시킴을 통하여 항염 효과가 있음을 확인하였고, 염증반응에 의해 유발되는 피부노화 및 염증 반응을 개선시킬 수 있는 치료제 또는 기능성 소재로서 D. undulata 추출물을 활용할 수 있음을 보여준다. 제아잔틴에 의한 RAW 264.7 세포의 항염효과에 대한 연구와 비교해 보면, 제아잔틴은 LPS에 의해 증가된 IL-1α/β 의 유전자 발현을 감소시키지 못하지만 본 연구에 사용된 D. undulata 추출물은 두 싸이토카인의 발현을 감소시키는 효과를 보이고 있다(Shim, 2019). 그리고 Figure 2, 3와 Figure 4D에서 보여주듯이 특별히 10 μg/mL농도의 D. undulata 추출물이 LPS에 의한 염증이 유도된 RAW 264.7 대식세포의 NO, PGE2, IL-6, TNF-α의 발현과 생성을 현저히 감소시키는 농도로 보이며, 기능성 화장품 등의 조성에 적절하게 활용할 수 있을 것이다. 주름뼈대그물말 추출물에 존재하는 생리활성물질에 isozonarol, isozonarone, chromazonarol, zonaric acid, isozonaroic acid와 같은 세스퀴테르페노이드가 있다는 선행연구가 있지만, 아직 어느 성분이 대식세포의 염증성 반응을 감소시키는 지에 대한 연구는 미진한 편이다(Kumagai et al., 2018). 후속 연구들을 통해 염증성 반응을 억제시키는 생리활성물질을 분석하는 연구가 필요할 것으로 보인다.
Conclusion
피부는 노화가 진행됨에 의해 탄력을 잃고 주름이 생성되고 과도하게 두꺼워지고 염증반응 등이 나타난다. 외부의 자극원인 자외선과 미세먼지, 세균 등에 의해 피부는 활성산소종과 NO 등의 연쇄 반응을 통해 노화가 더욱 촉진된다(Talwar et al., 1995; Kim et al., 2011). 또한 노화는 인체를 구성하는 정상적인 세포의 감소, 혹은 세포의 기능저하에 의해 조직의 재생 및 기능이 저하되게 된다(Kirkwood, 2005; Jones & Rando, 2011).
본 연구에서 D. undulata 추출물을 세포의 생존율에 영향을 끼치지 않으며 RAW 264.7 대식세포에 처리할 수 있는 농도를 확인할 수 있었다. 10 μg/mL 이하의 D. undulata 추출물 농도에서는 RAW 264.7 대식세포주의 생존율에 영향을 끼치지 않았다(Figure 1). NOS2, COX-2, IL-1α, IL-1β, IL-6 와 TNF-α 의 유전자 발현분석과 PGE2/NO 생성량 측정에서 D. undulata 추출물이 LPS에 의해 유도된 염증매개 인자의 발현을 유의성 있게 감소시키는 결과를 확인하였다(Figure 2-4). 이는 D. undulata 추출물이 피부 염증을 개선시킬 수 있는 새로운 후보물질로서의 가능성을 보여준다.
D. undulata 추출물이 염증을 억제할 수 있는 가능성을 보여준 연구는 본 연구가 최초이고, 기능성화장품 혹은 피부질환 및 염증개선 소재로서의 가능성을 확인할 수 있었고, 염증에 의한 피부노화를 완화시킬 수 있는 결과라 사료된다. 또한 향후 D. undulata 추출물이 어떠한 세포 내 기전에 의해 염증이 유발된 세포를 개선하는지에 대해 추가적인 세포신호 관련 연구 및 임상연구가 진행되어야 할 것으로 사료된다.
Acknowledgements
이 논문은 서울여자대학교 학술연구비의 지원에 의한 것임(2024-0021).
Notes
Author's contribution
JHS designed, performed experiments, analyzed data, and wrote the manuscript. All figures are created by the author.
Author details
Joong Hyun Shim (Professor), Department of BiohealthConvergence, Seoul Women`s University,621 Hwarang-ro, Nowon-gu, Seoul 01797, Korea.