Introduction
작약(Paeonia lactiflora)는 미나리재비과(Ranuclaceae) 작약속(Paeonia)에 속하는 허브로 한국, 중국 일본 등 동북아시아에 주로 재배되는 약재로 오랫동안 동양에서 보혈에 사용되어왔다. 작약은 색상과 형태가 다양한 꽃으로 인해 장식용으로 사용되고 있으며 뿌리는 방추형으로 길이가 약 20-30 cm 정도이고 굵기가 1-2 cm 정도로 약재로 사용된다(He & Dai, 2011; Li et al., 2021). 작약으로 호칭되는 식물로서 Paeonia lactiflora Pall, P. albifloria Pall., P. ovata Maxim. 및 P. japonica Myabe et Takeda 등이 우리나라 전역에 야생하거나 재배되는 것으로 보고되고 있으며 현재 대부분 P. lactiflora이거나 변종으로 분류되고 있다고 보고되었다(Sung et al., 2000). 작약은 전통적으로 복통, 고혈압 및 염증 등에 치료제로 이용되었으며 항산화 항암 등의 기능성 효능효과를 가진 것으로 보고되었다(Park et al., 2022; Liu et al., 2023). 작약의 대표적인 성분인 paeoniflorin, oxypaeoniflorin, albiflorin, pentagalloylglucose, benzoyl paeoniflorin 등의 성분이 알려져 있으며 항염효과에 뛰어난 효능을 가지고 있는 물질로 제약, 화장품 및 식품에서 사용되어진다(Choumg et al., 2003; Sung et al., 2020).
천연물의 폴리페놀에 대한 정량적 분석에 대한 연구는 수 십년 동안 진화되었다(Inoue & Hagerman, 1988). 가수분해가 가능한 탄닌은 단백질과 유사한 상호작용을 하지만 구조적으로 생리학적 활성과 기능을 결정할 수 있다(Rira et al., 2022). 식품 페놀성 중합체 중의 한 종류인 갈로탄닌은 가수분해에 의해 다가알코올과 갈릭산으로만 분해되는 에스터 계열의 화합물이다. 대표적인 갈로탄닌 화합물인 pentagalloylglucose는 달맞이꽃 기능성식품 지표성분 뿐만 아니라 망고, 작약, 오배자 등에 함유되어 있는 것으로 보고되었다(Torres-Le ó n et al., 2017). Pentagalloylglucose는 항균, 항암, 항바이러스 등의 질환의 치료에 약물로 유의한 효과가 보고되었으며, 특히 항산화, 항염 등의 화장품의 유효성분으로도 보고되었다(Feldman et al., 2001: Zhang et al., 2022). 이는 수용체 단백질의 결합과 안정화의 영향 뿐만 아니라 막의 변형에 영향을 주면서 활성을 나타낸다고 알려졌다(Beretta et al., 2011). 특히 달맞이꽃종자추출물은 pentagalloylglucose을 지표성분으로 식이보충에 유효한 기능을 가진 식품 원료로 개발되었다(Torres-Leon et al., 2016).
화장품 및 건강기능식품에서 기능성 원료에 대해 관심이 높아지는 원료를 특정할 수 있는 표준화 작업이 요구된다(Han et al., 2022; Kwon et al., 2022). 자연 유래 원료들의 효능은 지속적으로 보고되고 있으며 high-performance liquid chromatography (HPLC), gas chromatography (GC) 등을 통해 단일 성분의 규명을 통해 입증되고 있다(Na et al., 2016; Jung & Lee, 2022). 천연물에 기능성 성분을 추출하기 위해 용매 추출 및 초음파 등 추출조건에 따라 유효성분이 달라지기 때문에 목표 물질의 분리 및 설정을 위해 공정의 최적화는 필수적이다(Park et al., 2022; Bezerra et al., 2008; Jo & Choi, 2011). 일반적으로 지표성분을 확인하는 방법이 있으며 고시 외 화장품 및 건강기능식품으로 이용하기 위해 신규 원료를 지정할 때 지표성분을 설정하고 그 함량을 제시하도록 규정되어 있다. 규격은 association of official analytical chemists (AOAC) 등의 국내외 공인된 분석방법 또는 유효성이 검증된 분석법을 이용할 수 있으며 타당성 검토를 통해 확인한다(Han et al., 2022). 청가시덩굴 추출물의 resveratrol과 trans-scirpusin A의 개발 및 검증을 통해 기능성 원료 표준화를 위한 분석법을 보고하였으며 사군자추출분말의 quisqualic acid 성분의 분석법을 검증을 통한 표준화 연구가 보고되고 있다(Kwon et al., 2022; Kim et al., 2021). 이에 본 연구에서는 국내에서 재배되는 작약의 뿌리를 이용하여 pentagalloylglucose성분을 지표성분으로 설정하고 HPLC기기를 이용하여 최적의 분석법을 개발하고 유효성을 확인하였다.
Methods
1. 작약 뿌리 추출물 제조
본 실험에서 사용된 작약 뿌리는 ㈜토종마을에서 구입하였으며, 건조된 작약 뿌리 분쇄물 3 kg을 넣어 50℃에서 24 h 동안 추출하였다. 추출액을 상온으로 냉각 후 여과 및 농축하여 얻어진 농축액을 아세트산에틸 분획 후 감압농축 및 건조하여 분말로 제조한 시료를 약 2.5 g의 파우더를 수득하였다. 지표성분 분석을 위해 사용된 pentagalloylglucose는 Chemfaces (China)에서 구입 후 사용하였다.
2. 표준용액 조제
표준물질인 pentagalloylglucose의 제조는 Park et al. (2020)의 방법을 변형하였으며 구체적으로는 10 mg을 정밀하게 달아 메탄올에 녹여 10 mL 용량 플라스크에 넣어 용해하였다. 표준 원액을 희석하여 PTFE syringe filter (0.45 μm; Merck Millipore, USA)로 여과한 후 표준원액으로 사용하였다. 검량곡선 작성을 위해 단계적으로 희석하여 표준용액을 제조하여 HPLC 분석을 통해 pentagalloylglucose함량을 측정하였다.
3. 시험용액 조제
작약 뿌리 추출물은 Park et al. (2022)의 추출방법을 변형하여 조제하였다. 작약 뿌리 추출물 5 mg을 정밀하게 달아 80% 메탄올 50 mL를 가하여 초음파 추출기를 통해 30 min 용해하였다. 시험용액을 PTFE syringe filter (0.45 μm)로 여과하여 시험용액으로 사용하였다.
4. HPLC 분석
Pentagalloylglucose함량 분석은 Park 등의 방법을 변형하여 측정하였으며 액체크로마토그래피의 측정조건은 Table 1과 같다(Park et al., 2020). 분석 컬럼은 shim-pack GIS C18 (4.6 mm×250 mm, 5 μm; Shimadzu, Japan)을 사용하였고 HPLC는 shimadzu nexera lite HPLC-PDA system을 사용하였다. 이동상 용매는 아세토니트릴(Acetonitrile, ThermoFisher, USA)과 0.1% 트리플루오로아세트산(trifluoroacetic acid, ThermoFisher, USA)이 함유된 초순수(water)를 사용하였으며 모든 용매는 사용 전 탈기 및 필터 여과 후 사용하였다. 분석 시간은 0에서 40 min까지 이동상을 조절하였으며 분석 시료는 10 μL주입하였다. 컬럼의 유속은 1.0 mL/min, 온도는 40℃였으며 UV는 280 nm에서 측정하였다.
5. 시험방법의 검증
Pentagalloylglucose 분석법 확립은 AOAC 가이드라인등을 근거로 하여 지표성분의 특이성(specificity), 직선성(linearity), 정확성(accuracy), 정밀성(precision) 분석을 통하여 검증을 실시하였다(Han et al., 2022).
1) 특이성
특이성은 분석 대상이 다른 성분들에 혼재되어 있을 때 선택적으로 정확하게 측정할 수 있는 능력으로 표준용액과 시험용액의 chromatogram을 통해 지표성분인 pentagalloylglucose의 동일한 peak, retention time 및 spectrum을 나타내는지 HPLC를 통해 확인하였다.
2) 직선성
직선성은 표준용액을 이용하여 농도를 설정한 범위에 있는 분석 대상물질의 농도에 대해 직선적인 측정값을 얻어내는 능력으로 표준용액을 25-500 mg/L범위로 설정하여 기울기, 상관계수, 등을 통해 평가하였다. 식품의약품안전처의 기능성 원료 인정 가이드라인의 반응 표준편차와 검량선의 기울기에 근거하여 검출한계(limit of detection, LOD) 및 정량한계(limit of quantitation, LOQ)를 확인하였다.
Results and Discussion
1. Pentagalloylglucose분석조건의 확립
작약 뿌리 추출물에 함유되어 있는 지표물질인 pentagalloylglucose을 확인하기 위해 분석법 확립을 위해 HPLC분석에 필요한 컬럼, 이동상의 조성 및 UV검출 파장을 최적화하고 이에 대한 분석법 검증을 진행하였다.
2. 특이성 확인
HPLC조건으로 표준용액과 작약 뿌리 추출물의 시험용액을 크로마토그램을 비교하여 성분분리여부를 확인하였다. 그 결과 다른 성분과 간섭없이 단일한 피크로 명확히 분리되었으며 표준용액의 피크유지시간(retention time, RT)과 시험용액의 RT가 일치하였다(Figure 1). 또한, 표준용액과 작약 뿌리 추출물의 PDA spectrum을 측정한 결과에서도 215-280 nm의 범위에서 동일한 spectrum을 나타내었다. 감국과 레몬그라스 천연물을 이용하여 지표성분의 분석 조건의 특이성 검증은 UV spectrum을 비교하여 일치함을 통해 확인하였다고 보고되었다(Kim & Leem, 2020). 본 연구에서도 pentagalloylglucose을 확인하기 위한 특이성이 있음을 확인하였다.
3. 직선성 확인
시험방법이 각 농도별로 단계적으로 조제한 표준용액을 HPLC로 분석하여 피크 면적비에 대한 농도비의 관계를 표시하는 표준검량선을 작성하였다. Pentagalloylglucose의 농도 대비 크로마토그램의 피크 면적을 변수로 하여 검량선 및 상관계수(R2)를 통해 직선성을 확인한 결과 1-500 μg/mL의 농도범위에서 3회 분석하여 검량선의 상관계수는 0.9999이상의 높은 직진성을 나타내었다(Figure 2). 반복 측정한 검량선을 통해 도출된 검출한계는 0.92 μg/mL, 정량한계는 2.78 μg/mL로 나타났다. 선행 연구를 통해 기능성 원료 표준화를 위해 청가시덩굴 추출물의 resevertrol과 trans-scirpusin A 물질의 검량선 상관계수가 모두 0.9999로 우수한 직선성이 보고되었다(Kwon et al., 2022). 이런 결과를 토대로 본 시험법은 직선성이 있음을 확인하였다.
4. 정밀성 확인
반복성 및 실험실 내 정밀성을 통해 확인하였으며, 반복성 시험은 조제한 시험용액을 10회 반복하여 분석한 결과 평균 186.61±0.22%를 나타냈고 상대표준편차(relative standard deviation, RSD)는 0.12%로 나타났다. 실험실 내 정밀성은 동일한 실험실에서 각각 다른 시험자와 실험일에 분석하여 얻은 측정값들 사이의 근접성을 확인하여 실험실 내 정밀성을 확인하였다. 그 결과 RSD가 0.12-0.30%로 확인되었다(Table 2).
5. 정확성 확인
지표성분인 pentagalloylglucose를 농도별로 시험용액을 조제하여 각 3회씩 분석한 결과 표준물질 회수율은 50 μg/mL의 농도에서는 101.15±0.49%, 100 μg/mL의 농도에서는 101.71±0.50%, 150 μg/mL의 농도에서는 102.30±0.13%의 범위의 회수율을 보였으며 RSD는 0.12-0.50%로 나타나 본 시험법의 정확성을 확보하였다(Table 3). 정확성의 검증 시 분석성분 이외의 시료에 존재하는 기질의 영향을 고려하며 지표성분의 검출을 방해하거나 회수율에 영향을 준다고 보고되었다(Park et al., 2020). 본 연구에서는 평균 101.72±0.62%로 100% 회수율에 가까운 수치 통해 정확성을 확인하였다.
6. 작약 뿌리 추출물의 pentagalloylgulcose 함량
본 시험에서 확립된 분석법을 이용하여 작약 뿌리 추출물의 pentagalloylgulcose함량 분석을 진행하였다. 작약 뿌리 추출물에 대해 각 10 mg을 정밀하게 달아 80% 메탄올 50 mL를 가하여 용해 및 여과한 시험용액을 3회 반복 분석한 결과는 Table 4와 같다. 작약 뿌리 추출물 내 pentagalloylglucose의 함량은 약 12.49% 수준으로 함유되어 있었다. 이런 결과를 토대로 기능성 원료로서 작약 뿌리 추출물의 지표성분인 pentagalloylglucose의 분석이 가능함을 확인하였다.
Conclusion
본 연구에서는 작약 뿌리 추출물의 기능성 원료 개발을 위한 원료 표준화로 지표물질인 pentagalloylglucose의 HPLC 분석법을 확립하고 유효성을 검증하였다. Pentagalloylglucose분석은 HPLC 기기를 이용하여 0.1% trifluoroacetic acid와 acetonitrile용매를 이동상으로 하여 C18 역상 컬럼을 사용하여 280 nm파장에서 약 12 min에서 검출하였다. 표준용액과 시험용액의 농도별 검량선의 상관계수는 0.9999이상으로 나타나 높은 직선성을 확인하였으며, 검출한계는 0.92 μg/mL, 정량한계는 2.78 μg/mL로 나타났다. 반복성 시험에서 10회 반복한 RSD가 0.12%로 나타났으며 실험실 내 정밀성은 RSD가 0.12-0.30%로 확인되어 정밀성을 확인하였다. 또한, 정확성 분석을 위해 서로 다른 농도 3개를 선정하여 확인한 결과 RSD가 약 0.12-0.50%로 확인되었다. 결국 작약 뿌리 추출물의 pentagalloylglucose의 분석법을 확립하였으며 3회 반복 측정하여 약 12.49% 함유한 것으로 확인하였다. 본 시험법을 통해 작약 뿌리 추출물의 지표성분에 대한 식품의 개별인정형 원료 및 기능성 화장품 주성분 원료를 위한 pentagalloylglucose의 표준화를 위한 기초자료로 확인하였다. 추가적으로 기존 작약 뿌리 추출물에 함유되어 있는 성분들의 동시분석을 통해 유효 성분의 비교 검증을 통해 과학적으로 신뢰성이 있는 분석법 개발이 필요할 것으로 사료된다.
